小分子脾酪氨酸激酶(Syk)抑制劑篩選的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景：
　　 華東理工大學(xué)藥學(xué)院偶然發(fā)現(xiàn)了一個(gè)小分子化合物HL131012對Syk的激酶活性具有較強(qiáng)的抑制作用，針對HL131012結(jié)構(gòu)，按照傳統(tǒng)藥物化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾手段進(jìn)行了一系列結(jié)構(gòu)優(yōu)化研究，合成了48個(gè)衍生物，為求證該化合物的生物學(xué)活性，與我們合作本課題的研究。
　　 目的:
　　 測試這些衍生物對Syk的抑制活性，通過與陽性藥物(R935788)進(jìn)行對比，篩選出對滑膜細(xì)胞增殖抑制作用較好的小分子化合物，為

2、將來尋找到一種具有選擇性抑制Syk的藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:
　　 1．小分子化合物對Syk抑制活性的檢測：在固定條件下利用Caliper mobility shiftassay對HL131012及其48個(gè)衍生物的Syk激酶抑制作用進(jìn)行檢測，陰性對照為不加化合物(blank)組，陽性對照組采用陽性藥物Staurosporine（STS組）。每組設(shè)8個(gè)復(fù)孔。檢測項(xiàng)目是激酶Syk在ATP Km濃度下，共49個(gè)化合物梯

3、度稀釋的抑制百分率，稀釋成5個(gè)濃度點(diǎn)：50 uM，16.67 uM,5.56 uM，1.85 uM，0.62 uM，進(jìn)行單孔檢測。結(jié)果采用半數(shù)有效抑制濃度(IC50)表示。
　　 2.AA FLS的鑒定：購入佐劑型大鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎成纖維滑膜細(xì)胞，復(fù)蘇后穩(wěn)定傳代，取生長對數(shù)期的滑膜細(xì)胞，通過普通光鏡觀察滑膜細(xì)胞大體結(jié)構(gòu)、透射電鏡觀察滑膜細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測滑膜細(xì)胞血管粘附分子1(VCAM-1/CD106)、CD90、

4、CD34細(xì)胞表面分子表達(dá)情況對滑膜細(xì)胞型別進(jìn)行鑒定。
　　 3．MTT法觀察不同的小分子化合物對AA FLS增殖的影響：取生長對數(shù)期滑膜細(xì)胞，對第一步中篩選出的數(shù)種小分子Syk抑制劑化合物根據(jù)是否給予TNF-α刺激和Syk抑制劑干預(yù)隨機(jī)分成5組。①調(diào)零組：20％胎牛血清高糖DMEM+MTT+DMSO;②對照組：FLS+50ng/mL TNF-α+MTT+DMSO；③高濃度組:50ng/mLTNF-α+10umol/L Syk抑制

5、劑+MTT+DMSO;④中濃度組：50ng/mL TNF-α+5 umol/L。Syk抑制劑+MTT+DMSO；⑤低濃度組：50ng/mL TNF-α+2.5 umol/L Syk抑制劑+MTT+DMSO。用紫外線分光光度計(jì)選用493nm波長測定吸光度(A)值來測定細(xì)胞增殖反應(yīng)，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。各組結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-χ±S）表示，組間資料方差齊時(shí)采用單因素方差分析和snk檢驗(yàn)，用SPSS16.0軟件進(jìn)行分析，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)P=0.001，

6、P＜0.001為相差顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，比較分析抑制細(xì)胞增殖效果較好的一個(gè)或數(shù)個(gè)小分子Syk抑制化合物。
　　 結(jié)果:
　　 1．采用Caliper mobility shift assay對小分子化合物Syk抑制活性的檢測：HL131012本身及其48個(gè)衍生物中，有7個(gè)化合物(HL131012、HL131023、HL131041、HL131046、HL131047、HL131049和HL131057)對Syk的半數(shù)有效

7、抑制濃度(IC50值)較為滿意，這7個(gè)化合物抑制Syk活性的半數(shù)有效抑制濃度依次為：0.53uM，1.6μM,0.9μM,0.52μM,2μM,2.4μM,0.39μM。
　　 2.細(xì)胞培養(yǎng)至第三代時(shí)，普通光鏡觀察AA大鼠成纖維滑膜細(xì)胞生長形態(tài)均一，胞體成長梭形并伸出突起，透射電鏡觀察細(xì)胞突起長而粗，細(xì)胞內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富，缺乏高爾基復(fù)合體、小泡和囊泡；FCM檢測細(xì)胞VCAM-1(CD106)、CD90為陽性，CD34為陰性，符合

8、成纖維滑膜細(xì)胞典型形態(tài)學(xué)特征。
　　 3．不同的小分子化合物孵育AA FLS后，通過MTT比色法的分析吸光度A值，反應(yīng)AA FLS的增殖情況，與陽性藥物(R935788)進(jìn)行對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對抑制細(xì)胞增殖影響的滿意程度的化合物遞減順序依次為HL131057，HL131049，HL131041，HL131046, HL131023, R935788。
　　 結(jié)論:
　　 1．HL131012本身及其48個(gè)衍生物中，其

9、中7個(gè)化合物(HL131012、HL131023、HL131041、HL131046、HL131047、HL131049和HL131057)表現(xiàn)出較強(qiáng)的Syk抑制效果；
　　 2．部分小分子Syk抑制劑化合物能抑制TNF-α刺激的滑膜細(xì)胞的增生，這些化合物抑制細(xì)胞增殖按作用效果遞減順序依次為HL131057，HL131049，HL131041,HL131046, HL131023, HL131046, HL131012;