酪氨酸激酶抑制劑細胞篩選模型的構(gòu)建及應用.pdf

1、目的： 建立針對以血小板衍生生長因子受體-β（platelet-derived growth factor receptor-β，PDGFR-β）和血管內(nèi)皮生長因子受體-2（vascular endothelial growth factor receptor-2，VEGFR-2）為靶標的特異及靈敏的細胞模型體系，用于酪氨酸激酶受體（receptor tyrosine kinase，RTK）抑制劑的篩選和研究。 方法：

2、 1、pcDNA3.1-PDGFR-β和pcDNA3.1-VEGFR-2真核表達載體的構(gòu)建：利用TRIZOL提取人胚肝二倍體細胞（CCC-HEL）的總RNA，運用RT-PCR方法擴增目的片段PDGFR-β和VEGFR-2。分別將其定向插入pcDNA3.1表達載體的限制性酶切位點KpnⅠ和XbaⅠ之間，構(gòu)建pcDNA3.1-PDGFR-β和pcDNA3.1-VEGFR-2。分別利用PCR初步鑒定重組表達載體pcDNA3.1-PDGF

3、R-β和pcDNA3.1-VEGFR-2，再經(jīng)KpnⅠ和XbaⅠ雙酶切鑒定pcDNA3.1-PDGFR-β和pcDNA3.1-VEGFR-2，最后測序進一步鑒定pcDNA3.1-PDGFR-β和pcDNA3.1-VEGFR-2序列的準確性。 2、NIH3T3穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株的建立和鑒定：把重組表達載體pcDNA3.1-PDGFR-β和pcDNA3.1-VEGFR-2采用磷酸鈣共沉淀法分別轉(zhuǎn)染至NIH3T3細胞株，利用G418的藥物

4、選擇特性，對轉(zhuǎn)染細胞進行壓力篩選，并對其進行RT-PCR鑒定，最后運用Western blot檢測目的基因蛋白表達情況。 3、NIH3T3穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株功能學的鑒定：采用MTT法在穩(wěn)定表達PDGFR-β或VEGFR-2的NIH3T3細胞株對其配體和時間依賴性生長實驗。結(jié)果提示NIH3T3穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株獲得了PDGF/VEGF因子依賴性增殖/存活特征。 4、HeLa瞬時轉(zhuǎn)染細胞株的建立和鑒定：把重組表達載體pcDNA3.1-P

5、DGFR-β和pcDNA3.1-VEGFR-2采用FuGENE6試劑分別轉(zhuǎn)染HeLa細胞株，運用RT-PCR和Western blot檢測PDGFR-β/VEGFR-2.的基因和蛋白表達情況。 5、細胞模型的應用： （1）高通量酪氨酸激酶抑制劑細胞篩選平臺的建立及應用分別在穩(wěn)定表達PDGFR-β/VEGFR-2的NIH3T3細胞株及HUVCE細胞株（天然表達VEGFR-2）上，應用MTT檢測方法，對候選的化合物進行了PD

6、GF/VEGF依賴性細胞增殖抑制作用的篩選。 （2）PDGFR-β和VEGFR-2磷酸化分析平臺的建立及應用對篩選出具有PDGF/VEGF依賴性細胞增殖抑制作用的先導化合物在瞬時轉(zhuǎn)染PDGFR-β/VEGFR-2的HeLa細胞株上，應用Western blot檢測手段，觀察先導化合物對PDGF/VEGF依賴性受體磷酸化的抑制作用。在HUVCE細胞株上，應用免疫沉淀和Western blot檢測手段，觀察先導化合物對VEGF依賴性

7、受體磷酸化的抑制作用。 6、統(tǒng)計采用SPSS12.0分析軟件進行分析，具體采用卡方檢驗、t檢驗及Spearman相關性檢驗進行分析，當P<0.05，認為有統(tǒng)計學意義。 結(jié)果： 1、真核表達載體pcDNA3.1-PDGFR-β和pcDNA3.1-VEGFR-2經(jīng)測序其目的片段與理論預計一致。 2、對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染NIH3T3細胞株和瞬時轉(zhuǎn)染HeLa細胞株行RT-PCR和Western blot檢測結(jié)果分別證實目的

8、基因整合入細胞基因組，且顯著表達PDGFR-β/VEGFR-2蛋白。 3、在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染NIH3T3細胞株上，進行配體和時間依賴性生長實驗結(jié)果提示它們具有PDGF或VEGF因子依賴性增殖/存活特征。 4、經(jīng)PDGF和VEGF依賴性細胞增殖實驗的篩選具有針對PDGF和/或VEGF先導化合物，進一步對其進行受體磷酸化抑制作用的測定結(jié)果顯示：它們具有對PDGFR-β和/或VEGFR-2磷酸化的顯著抑制作用。 結(jié)論：

9、 1、通過分子克隆、細胞轉(zhuǎn)染等方法分別成功構(gòu)建穩(wěn)定表達PDGFR-β或VEGFR-2的NIH3T3細胞株，并在此基礎上成功建立酩氨酸激酶抑制劑的高通量細胞篩選平臺（High throughput screening，HTS）。 2、通過分子克隆、細胞轉(zhuǎn)染等方法分別成功構(gòu)建瞬時表達PDGFR-β或VEGFR-2的HeLa細胞株。也在此基礎上成功建立酪氨酸激酶抑制劑的受體磷酸化分析平臺。 3、在HUVCE細胞株上，成功構(gòu)建V