自噬在吉非替尼肝臟毒性中的作用及其機制研究.pdf

1、目的：吉非替尼(Gefitinib)是目前臨床應用最廣泛的酪氨酸激酶抑制劑之一，但其嚴重的肝臟毒性常造成部分患者中斷治療，甚至導致個別患者的死亡。而目前針對其毒性機制尚無研究報道，更缺乏有效的干預手段。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，Gefitinib可通過誘導肝細胞凋亡導致肝臟毒性，自噬可能參與該毒性發(fā)生過程。本課題旨在探索自噬在Gefitinib肝臟毒性中的作用，闡明自噬與凋亡之間的相互關(guān)系，并基于此研究干預Gefitinib肝臟損傷的新策略，拓

2、展其臨床應用。
　　方法：⑴建立Gefitinib肝臟毒性ICR小鼠模型，通過肝臟臟器指數(shù)，血液生化指標谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和乳酸脫氫酶(LDH)以及蘇木精-伊紅染色法(HE)分析病理切片，確證Gefitinib肝臟毒性的發(fā)生。采用cre-loxp系統(tǒng)建立肝臟特異性敲除自噬關(guān)鍵基因Atg7的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，并結(jié)合肝臟臟器指數(shù)、血液生化指標、HE病理切片以及免疫組化等實驗手段考察自噬與Gefitinib肝臟損傷

3、的關(guān)系，以及初步確證自噬對肝細胞凋亡的調(diào)控作用。⑵應用TMT定量蛋白質(zhì)組學分析尋找并確證Gefitinib誘導自噬降解的關(guān)鍵蛋白；采用溶酶體抑制劑氯喹(CQ)抑制自噬，結(jié)合western blot驗證Gefitinib誘導自噬降解的可能底物蛋白；采用小分子RNA干擾技術(shù)沉默Atg5，以排除小分子抑制劑脫靶效應，結(jié)合western blot確證Gefitinib誘導自噬降解的底物蛋白為COX6A1；根據(jù)電鏡結(jié)果，統(tǒng)計對照組與給藥組小鼠肝細

4、胞內(nèi)線粒體數(shù)目，western blot檢測線粒體基質(zhì)蛋白Hsp60和膜蛋白Tomm20，考察線粒體數(shù)目的變化；分離肝細胞內(nèi)線粒體，western blot檢測Gefitinib作用下胞漿和線粒體中COX6A1蛋白水平的變化；Western blot檢測Gefitinib不同濃度和時間作用下肝細胞L02中COX6A1蛋白水平的變化；Western blot檢測ICR小鼠肝臟中Gefitinib作用下COX6A1蛋白水平的變化；構(gòu)建過表達

5、COX6A1細胞，結(jié)合western blot和PI染色結(jié)合流式細胞術(shù)考察過表達COX6A1對肝細胞凋亡的影響；采用real-time PCR(RT-PCR)實驗考察Gefitinib對COX6A1 mRNA水平的影響；采用蛋白合成抑制劑放線菌酮(CHX)與Gefitinib共同作用，結(jié)合western blot考察Gefitinib對COX6A1蛋白合成水平的影響；采用蛋白酶體抑制劑MG132與Gefitinib共同作用，結(jié)合west

6、ern blot考察泛素蛋白酶體通路在COX6A1蛋白下調(diào)中的作用；采用選擇性PI3K抑制劑3-MA抑制自噬，結(jié)合western blot考察自噬溶酶體通路在Gefitinib誘導COX6A1下調(diào)中的作用；采用自噬關(guān)鍵基因Atg5、Atg7敲除的MEF細胞，自噬關(guān)鍵基因Atg7敲除的肝臟組織，進一步考察自噬溶酶體通路在Gefitinib干預COX6A1蛋白穩(wěn)定性中的作用。⑶采用SRB染色法、western blot考察Gefitinib

7、、Erlotinib和Afatinib作用下肝細胞中COX6A1蛋白水平的變化；采用小分子RNA干擾技術(shù)沉默肝細胞中表皮生長因子受體(EGFR)蛋白，結(jié)合western blot考察肝細胞中COX6A1、c-PARP和LC3蛋白水平的變化，探討Gefitinib作用靶點EGFR在其自噬中的作用；采用western blot考察在Gefitinib作用后PLK1蛋白水平的變化；采用RT-PCR考察Gefitinib對PLK1 mRNA水平

8、的影響；肝組織切片進行HE染色和免疫組化實驗考察PLK1與損傷部位共定位情況；通過ICR小鼠模型，采用血液生化指標和western blot檢測確定PLK1蛋白水平變化與Gefitinib誘導肝臟損傷發(fā)生時間先后關(guān)系；沉默和過表達PLK1蛋白，結(jié)合western blot考察其與Gefitinib誘導的肝細胞自噬之間的關(guān)系；Western blot檢測PLK1抑制劑BI-2536對Gefitinib誘導的肝細胞自噬的影響；PI染色結(jié)合流

9、式細胞術(shù)考察PLK1抑制劑BI-2536對Gefitinib誘導的肝細胞凋亡的影響；采用ICR小鼠模型，結(jié)合肝臟臟器指數(shù)，血液生化指標和HE病理切片檢測，研究PLK1抑制劑BI-2536在體內(nèi)對Gefitinib肝臟毒性的保護作用；采用肺癌細胞PC9、H1299和H460，采用SRB染色法檢測PLK1抑制劑BI-2536對Gefitinib抗腫瘤藥效的影響。
　　結(jié)果：①Gefitinib200 mg/kg灌胃給于ICR小鼠4周后

10、，出現(xiàn)了與臨床報道一致的肝臟功能紊亂。肝臟臟器指數(shù)與對照組比明顯升高，從對照組的4.05±0.33％升高到Gefitinib給藥組的5.24±0.61％。Gefitinib給藥組血清中的ALT、AST和LDH含量是對照組的2～10倍。Gefitinib給藥組肝臟切片進行HE染色，結(jié)果顯示肝臟出現(xiàn)嗜酸性變。進一步采用免疫組化法檢測肝臟組織切片中cleaved-PARP（c-PARP）蛋白的表達情況，發(fā)現(xiàn)損傷部位c-PARP明顯升高。TUN

11、EL染色結(jié)果也顯示Gefitinib給藥組小鼠肝組織切片中，綠色熒光強度明顯增加。以上結(jié)果表明Gefitinib誘導肝細胞凋亡可能是其誘導損傷的原因。SRB染色法實驗證實Gefitinib可顯著抑制肝細胞L02增殖能力，計算得出IC50為19.9μM。AnnexinⅤ/PI雙染結(jié)合流式細胞術(shù)檢測細胞死亡方式，結(jié)果顯示，肝細胞凋亡比例隨Gefitinib給藥濃度或時間的增加而增加。DAPI染色結(jié)果顯示Gefitinib作用后細胞核出現(xiàn)了典

12、型的凋亡特征，細胞核明顯固縮，同時出現(xiàn)凋亡小體。Western blot結(jié)果顯示，Gefitinib作用后肝細胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白PARP切割片段c-PARP明顯增加。以上結(jié)果從體內(nèi)外證實Gefitinib通過誘導肝細胞凋亡，進而引發(fā)肝臟毒性。②采用免疫透射電鏡實驗發(fā)現(xiàn)Gefitinib組小鼠肝臟組織出現(xiàn)典型自噬泡結(jié)構(gòu)。Western blot結(jié)果也表明Gefitinib給藥組小鼠肝臟組織中自噬標記蛋白LC3Ⅰ型向LC3Ⅱ型轉(zhuǎn)換明顯增加。采

13、用免疫組化法檢測Gefitinib組小鼠肝臟組織切片中LC3蛋白的表達情況，發(fā)現(xiàn)損傷部位LC3明顯升高且成點狀聚集。進一步在體外肝細胞L02中，免疫透射電鏡也檢測到Gefitinib作用后出現(xiàn)的自噬泡結(jié)構(gòu)。AO染色結(jié)合流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，Gefitinib不同濃度0μM、5μM、10μM和20μM和Gefitinib20μM濃度下不同時間0、6、12和24小時對應的AO陽性細胞率分別為14.01±3.22％、19.78±1.51％、

14、21.34±5.97％、37.46±4.07％和14.88±0.63％、16.76±3.80％、24.40±1.95％、40.01±7.67％，AO陽性細胞比例隨Gefitinib給藥濃度或時間的增加而增加。Westernblot結(jié)果顯示Gefitinib組肝細胞自噬標記蛋白LC3Ⅰ型向LC3Ⅱ型轉(zhuǎn)換明顯增加。以上結(jié)果從體內(nèi)外證實，Gefitinib誘導肝細胞凋亡同時誘導自噬。③采用Caspase泛抑制劑Z-VAD-FMK抑制Gefit

15、inib引起的肝細胞凋亡，PI染色結(jié)合流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，肝細胞凋亡率從52.95±20.70％降至20.59±18.50％。而SRB染色實驗和western blot結(jié)果顯示，抑制肝細胞凋亡并不影響Gefitinib誘導的自噬發(fā)生和細胞數(shù)目減少。采用小分子RNA干擾技術(shù)沉默自噬關(guān)鍵蛋白Atg5的表達，western blot實驗結(jié)果顯示，抑制自噬可以逆轉(zhuǎn)Gefitinib引起的c-PARP增加。SRB染色實驗結(jié)果顯示，抑制自噬后細胞存

16、活率從Gefitinib作用后的55.12±4.58％回升到86.41±0.81％。PI染色結(jié)合流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，抑制自噬后肝細胞肝細胞凋亡率從57.22±11.25％降至24.72±4.17％。以上結(jié)果初步說明抑制自噬可以抑制Gefitinib引起的肝細胞凋亡，進而逆轉(zhuǎn)Gefitinib肝臟毒性。進一步采用肝臟特異性敲除自噬關(guān)鍵基因Atg7的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，肝臟臟器指數(shù)、血液生化指標和HE病理切片結(jié)果顯示，抑制自噬可以保護Gefit

17、inib引起的肝毒性。肝臟免疫組化結(jié)果顯示，抑制自噬可以抑制Gefitinib引起的肝細胞凋亡。以上結(jié)果從體內(nèi)外證實自噬是Gefitinib引起肝細胞凋亡，進而導致肝臟毒性的關(guān)鍵原因。④TMT定量蛋白質(zhì)組學發(fā)現(xiàn)COX6A1是Gefitinib介導自噬降解的底物蛋白Western blot結(jié)果顯示，CQ作用下蛋白LC3-Ⅰ型向LC3-Ⅱ型轉(zhuǎn)換明顯增加，說明CQ抑制自噬溶酶體以及其包含蛋白的降解。我們將對照組，Gefitinib給藥組和Ge

18、fitinib+ CQ組進行TMT定量蛋白質(zhì)組學分析，質(zhì)譜鑒定得到6448個差異蛋白。我們對變化倍數(shù)大于1.3的蛋白進一步進行分析，Gefitinib作用下蛋白水平下降的有36個，合用CQ后蛋白水平回升的有18個，在兩者中相同的蛋白有3個，分別為B2M，COX6A1和TUBB8。Western blot結(jié)果顯示，Gefitinib引起的這三個蛋白的降解均能夠被CQ逆轉(zhuǎn)。進一步采用小分子RNA干擾技術(shù)沉默Atg5抑制自噬，只有COX6A1

19、能夠被逆轉(zhuǎn)，B2M和TUBB8則不可以，說明CQ所逆轉(zhuǎn)B2M和TUBB8是自噬溶酶體途徑非依賴的。統(tǒng)計電鏡實驗中對照組和給藥組小鼠肝細胞內(nèi)線粒體數(shù)目，結(jié)果顯示兩者沒有顯著變化。同時western blot結(jié)果顯示給予Gefitinib不影響線粒體基質(zhì)蛋白Hsp60和線粒體膜蛋白Tomm20蛋白水平。分離線粒體與細胞漿，western blot結(jié)果顯示，Gefitinib作用后線粒體內(nèi)COX6A1蛋白水平顯著下降。給予肝細胞L02不同濃度

20、和時間的Gefitinib，western blot結(jié)果顯示，COX6A1蛋白水平的下調(diào)具有濃度和時間依賴性。ICR小鼠肝臟組織中，Gefitinib作用下COX6A1蛋白水平也顯著下降。以上結(jié)果表明，COX6A1可能是Gefitinib介導自噬降解的底物蛋白。⑤構(gòu)建過表達COX6A1蛋白的肝細胞，給予Gefitinib作用24小時。Western blot結(jié)果顯示，過表達COX6A1能夠逆轉(zhuǎn)Gefitinib引起的c-PARP增加。P

21、I染色結(jié)合流式細胞術(shù)檢測顯示，過表達COX6A1能夠減少Gefitinib引起的肝細胞凋亡，肝細胞凋亡率從Gefitinib給藥后的53.89±14.27％降到28.39±3.46％。以上結(jié)果說明，COX6A1可能是Gefitinib誘導肝細胞凋亡的關(guān)鍵原因。⑥采用RT-PCR檢測，結(jié)果顯示Gefitinib作用下，COX6A1 mRNA水平并不隨著時間濃度變化而變化，說明Gefitinib不影響COX6A1轉(zhuǎn)錄水平。采用蛋白合成抑制劑

22、CHX結(jié)合western blot結(jié)果顯示，Gefitinib不影響COX6A1的蛋白合成水平，提示蛋白降解途徑參與Gefitinib誘導的COX6A1下調(diào)。通過泛素蛋白酶體抑制劑MG132證實Gefitinib作用下COX6A1的下調(diào)不經(jīng)由泛素蛋白酶體途徑。采用選擇性PI3K抑制劑3-MA抑制自噬，western blot結(jié)果顯示，Gefitinib誘導的COX6A1蛋白下調(diào)能夠被逆轉(zhuǎn)，初步證實COX6A1經(jīng)由自噬溶酶體途徑降解。進一

23、步對敲除自噬關(guān)鍵基因Atg5以及Atg7的MEF細胞，自噬關(guān)鍵基因Atg7敲除的肝臟組織的運用，確證了Gefitinib誘導COX6A1經(jīng)由自噬溶酶體通路降解。⑦采用其他EGFR抑制劑Erlotinib和Afatinib考察Gefitinib介導的COX6A1自噬降解是否是其靶點效應，通過SRB染色法確定Erlotinib和Afatinib在肝細胞上作用濃度分別為20μM和5μM，western blot結(jié)果顯示，僅在Gefitinib

24、作用下COX6A1蛋白下調(diào)，而Erlotinib和Afatinib作用下不變。進一步采用小分子RNA干擾技術(shù)沉默EGFR，western blot結(jié)果顯示沉默EGFR也不引起肝細胞內(nèi)COX6A1蛋白的下調(diào)，且沉默EGFR并不影響Gefitinib誘導自噬的發(fā)生和細胞凋亡的發(fā)生。⑧采用western blot檢測PLK1在Gefitinib作用下變化情況，結(jié)果顯示，PLK1隨Gefitinib作用濃度和時間的增加而增加。同時在原代肝細胞中

25、也觀察到相同現(xiàn)象。采用RT-PCR檢測，結(jié)果顯示Gefitinib作用下，PLK1 mRNA水平隨著時間濃度變化而變化，說明Gefitinib通過影響PLK1轉(zhuǎn)錄水平增加其蛋白表達。采用HE染色結(jié)合免疫組化進一步分析，結(jié)果顯示，在肝細胞損傷部位PLK1表達顯著升高。體內(nèi)ICR小鼠不同時間的血清及肝臟組織結(jié)果顯示，Gefitinib給藥后血液生化指標在第三周才開始出現(xiàn)變化，而肝臟中PLK1蛋白水平則在第二周出現(xiàn)明顯升高。以上結(jié)果說明肝細胞

26、中PLK1蛋白水平在Gefitinib給藥后顯著升高，并且早于肝損傷的發(fā)生，提示PLK可能與Gefitinib誘導的肝臟損傷存在著密切的關(guān)系。采用小分子RNA干擾技術(shù)沉默PLK1表達，western blot結(jié)果顯示沉默PLK1可以顯著抑制Gefitinib引起的肝細胞自噬，而過表達PLK1蛋白則會引起肝細胞自噬。以上結(jié)果說明，Gefitinib可通過上調(diào)PLK1，進而誘導肝細胞自噬，最終引起肝臟毒性。⑨前期結(jié)果提示PLK可能是Gefi

27、tinib肝臟毒性的干預靶點。我們采用PLK1抑制劑BI-2536與Gefitinib進行合用，western blot結(jié)果顯示BI-2536可以抑制Gefitinib引起的肝細胞LC3-Ⅰ型向LC3-Ⅱ型轉(zhuǎn)換。PI染色結(jié)合流式細胞術(shù)檢測顯示，BI-2536可以抑制Gefitinib引起的肝細胞凋亡，凋亡率從Gefitinib作用后的47.78±13.41下降到30.43±5.96％。體內(nèi)ICR小鼠實驗結(jié)果顯示，BI-2536可以使肝臟

28、臟器指數(shù)回到正常水平，從Gefitinib給藥組的5.11±0.38％回到4.22±0.25％。同時BI-2536還可逆轉(zhuǎn)Gefitinib引起的肝臟血液生化指標的升高。肝組織HE染色結(jié)合免疫組化實驗結(jié)果顯示，BI-2536通過抑制體內(nèi)肝細胞自噬，進而抑制肝細胞凋亡，最終阻止Gefitinib肝臟毒性的發(fā)生。為了進一步驗證PLK1抑制劑作為Gefitinib肝臟毒性干預策略的臨床可行性，我們考察了BI-2536對Gefitinib抗腫瘤

29、藥效的影響。在Gefitinib敏感細胞株非小細胞肺癌PC9，以及不敏感的肺癌細胞H1299和H460中，合用BI-2536不影響Gefitinib的抗腫瘤效應。以上結(jié)果說明，BI-2536在對抗Gefitinib肝臟毒性的同時，不會影響其抗腫瘤效果。
　　結(jié)論：自噬是肝細胞凋亡依賴的Gefitinib肝臟毒性的關(guān)鍵原因。自噬促使線粒體相關(guān)蛋白COX6A1發(fā)生自噬溶酶體途徑降解，進而引起肝細胞凋亡。PLK1參與調(diào)控Gefitini