小劑量阿司匹林協(xié)同干擾素-α誘導(dǎo)肝癌BEL-7402細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:肝癌全身治療措施療效不佳已成為進(jìn)一步提高肝癌遠(yuǎn)期療效的瓶頸。IFN-α具有抗病毒感染、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡以及抗腫瘤血管生成等生物學(xué)作用，目前已被廣泛應(yīng)用于肝癌等惡性腫瘤的防治過(guò)程中。但長(zhǎng)期大劑量使用IFN-α所導(dǎo)致的毒性反應(yīng)、產(chǎn)生的耐藥性及高昂的治療費(fèi)用，限制了IFN-α在臨床上的廣泛應(yīng)用。本課題擬就小劑量阿司匹林協(xié)同IFN-α誘導(dǎo)肝癌BEL-7402細(xì)胞凋亡的作用及其相關(guān)機(jī)制進(jìn)行初步研究，以期增

2、強(qiáng)IFN-α臨床療效，減少用藥劑量及時(shí)間，為臨床聯(lián)合應(yīng)用小劑量阿司匹林和IFN-α防治肝細(xì)胞肝癌提供理論依據(jù)和實(shí)踐基礎(chǔ)。
　　 方法:1.分組情況:分為四組，分別為:空白對(duì)照組、5000U/mlIFN-α組、小劑量1mM阿司匹林組、5000U/mlIFN-α+小劑量1mM阿司匹林即聯(lián)合用藥組;
　　 2.觀察指標(biāo)及方法:體外培養(yǎng)的人肝癌BEL-7402細(xì)胞經(jīng)IFN-α單獨(dú)或聯(lián)合小劑量阿司匹林處理后，采用MTT法測(cè)定細(xì)胞的

3、增殖情況;流式細(xì)胞術(shù)分析不同組藥物對(duì)BEL-7402細(xì)胞凋亡的影響，WesternBlot檢測(cè)BEL-7402細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的變化。
　　 3.信號(hào)傳導(dǎo)通路等機(jī)制研究:采用WesternBlot檢測(cè)IFN-α單獨(dú)或聯(lián)合小劑量阿司匹林作用于BEL-7402細(xì)胞后JAK-STAT1/3通路的變化;采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)IFN-α單獨(dú)或聯(lián)合小劑量阿司匹林作用于BEL-7402細(xì)胞18h時(shí)凋亡相關(guān)ISGs表達(dá)變化情況。

4、r>　　 結(jié)果:1.小劑量阿司匹林可單獨(dú)并協(xié)同IFN-α抑制肝癌BEL-7402細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，處理24h時(shí)，小劑量阿司匹林不能抑制肝癌增殖，IFN-α可明顯抑制其增殖，聯(lián)合用藥組與IFN-α組相比，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）;作用48h和72h時(shí)，IFN-α和小劑量阿司匹林均可抑制肝癌細(xì)胞增殖，聯(lián)合用藥組與單獨(dú)用藥組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05），說(shuō)明小劑量阿司匹林在作用48h后可單獨(dú)并協(xié)同IF

5、N-α抑制BEL-7402細(xì)胞增殖。
　　 2.小劑量阿司匹林可單獨(dú)并協(xié)同IFN-α誘導(dǎo)肝癌BEL-7402細(xì)胞凋亡
　　 經(jīng)藥物處理48h后，IFN-α組和阿司匹林組細(xì)胞凋亡率分別為14.61±2.18％和13.70±0.89％，較空白對(duì)照組（9.18±0.79％）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);聯(lián)合用藥組細(xì)胞凋亡率為31.90±2.25％，與單獨(dú)用藥組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。說(shuō)明IFN-α和小劑量阿

6、司匹林單獨(dú)作用48h時(shí)均可誘導(dǎo)部分腫瘤細(xì)胞凋亡，但二者聯(lián)合作用時(shí)細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯增加。
　　 3.小劑量阿司匹林通過(guò)內(nèi)源性凋亡通路協(xié)同IFN-α誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，該作用與Bax表達(dá)的增加有關(guān)
　　 IFN-α或阿司匹林單獨(dú)作用于肝癌BEL-7402細(xì)胞48h后，細(xì)胞caspase-3的表達(dá)增加，IFN-α組可見(jiàn)少量caspase-3的激活，caspase-9的表達(dá)和活性均明顯升高，而caspase-8的表達(dá)和活性均未見(jiàn)明

7、顯變化，二者聯(lián)合作用后caspase-3及caspase-9的活性較單獨(dú)用藥組明顯增高，提示內(nèi)源性凋亡通路在二者協(xié)同誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥組促凋亡蛋白Bax表達(dá)較單獨(dú)用藥組明顯增高，而抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl和Mcl-1的表達(dá)未見(jiàn)明顯變化，說(shuō)明該內(nèi)源性凋亡通路的啟動(dòng)可能與Bax表達(dá)的增加有關(guān)。
　　 4.小劑量阿司匹林可通過(guò)激活STAT1通路增強(qiáng)IFN-α誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡

8、　　 IFN-α可明顯激活JAK/STATs通路，其中STAT1和STAT3在其抗腫瘤作用中發(fā)揮著重要作用。小劑量阿司匹林可促進(jìn)IFN-α作用下STAT1的激活，而對(duì)STAT3的表達(dá)和激活均未產(chǎn)生明顯影響。并且，小劑量阿司匹林可促進(jìn)IFN-α作用下STAT1的表達(dá)，由于STAT1表達(dá)的降低或缺失會(huì)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞IFN-α耐藥性的產(chǎn)生，提示小劑量阿司匹林可能具有延緩甚至逆轉(zhuǎn)IFN-α耐藥性的作用。
　　 5.小劑量阿司匹林增強(qiáng)IF

9、N-α作用下STAT1的激活通過(guò)JAK2來(lái)實(shí)現(xiàn)
　　 在人肝癌BEL-7402細(xì)胞中，小劑量阿司匹林可促進(jìn)IFN-α作用下JAK2的激活，但I(xiàn)FN-α對(duì)TYK2的激活作用受到抑制，JAK1的激活未被檢測(cè)到，說(shuō)明小劑量阿司匹林促進(jìn)IFN-α對(duì)STAT1的激活過(guò)程是通過(guò)促進(jìn)其上游通路分子JAK2的磷酸化過(guò)程實(shí)現(xiàn)的。在JAK2活性被其特異性抑制劑AG490抑制后，IFN-α聯(lián)合小劑量阿司匹林對(duì)STAT1和STAT3的激活均受到明顯抑制

10、，說(shuō)明在肝癌BEL-7402細(xì)胞中，JAK2不僅參與了對(duì)STAT1的激活，亦參與了STAT3的激活過(guò)程。
　　 6.小劑量阿司匹林通過(guò)調(diào)控干擾素刺激基因(interferon-stimulatedgenes，ISGs)的表達(dá)介導(dǎo)了IFN-α誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡
　　 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明，在作用18h時(shí)，小劑量阿司匹林可促進(jìn)IFN-α作用下促凋亡ISGXAF-1的表達(dá)，抑制抗凋亡ISGG1P3的表達(dá)。由于XAF-

11、1及G1P3均參與了細(xì)胞內(nèi)源性凋亡途徑的調(diào)控過(guò)程，因此我們推測(cè)小劑量阿司匹林協(xié)同IFN-α抑制肝癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)IFN-α誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的凋亡過(guò)程，可能與XAF-1表達(dá)增加和G1P3表達(dá)抑制有關(guān)。
　　 結(jié)論:1.小劑量阿司匹林可通過(guò)JAK2/STAT1協(xié)同IFN-α抑制肝癌BEL-7402細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡;
　　 2.小劑量阿司匹林通過(guò)內(nèi)源性凋亡通路誘導(dǎo)肝癌BEL-7402細(xì)胞凋亡，其caspase-9及cas