ASAP3對人肝癌細胞侵襲轉移能力的影響.pdf

1、肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是我國最常見惡性腫瘤之一，腫瘤細胞侵襲和轉移是成功治療HCC的最大障礙，也是造成癌癥患者死亡的主要原因。目前肝細胞癌的侵襲和轉移機制還不很清楚，因此探索腫瘤侵襲和轉移的機制、尋找抑制腫瘤侵襲和轉移的有效靶點，一直是國內外研究的熱點。ASAP3（ARF-GAP containing SH3，ANK repeats and PH dommn3），又名UPLCl、ACAP4、

2、DDEFLl，是ARF(ADP ribosylation factor)-GAPs(GTPase Activiting Protein)家族的一個新發(fā)現的成員。與該家族的大部分成員一樣，該蛋白具有BAR、PH、GAP和ANK等多個結構域，可能在細胞內囊泡運輸、細胞骨架組裝、細胞生長、細胞遷移等方面發(fā)揮著重要的作用。研究表明，ASAP3在人肝細胞癌中超量表達。本課題通過ASAP3特異性siRNA和ASAP3真核表達載體分別在高轉移性和低轉

3、移性的HCC細胞株（MHCC97H和Hep3B）中抑制和增強ASAP3的表達，探討ASAP3基因表達與HCC腫瘤細胞增殖、凋亡和侵襲轉移之間的關系，旨在為其臨床應用研究提供理論基礎和實驗依據，并為以此為靶點進行HCC防治研究提供新策略。
　　目的：構建ASAP3-siRNA表達載體和ASAP3真核表達載體并將之轉染入侵襲轉移潛力不同的肝癌細胞中以獲得ASAP3基因“沉默”和“增強”的HCC細胞，在此基礎上，揭示ASAP3與肝癌細胞

4、侵襲轉移潛能之間的關系，為肝癌的基因治療提供新的靶點和實驗資料。
　　方法：（1）利用生物信息學技術在線設計特異性ASAP3和GAPDH-siRNA，在體外構建和克隆ASAP3和GAPDH-siRNA表達載體（pASAP3-siRNA和pGAPDH-siRNA）；（2）將ASAP3-siRNA表達載體及pGAPDH-siRNA分別瞬時轉染MHCC97H肝癌細胞中，以未轉染細胞作為陰性對照；RT-PCR法檢測肝癌細胞株MHCC97H

5、細胞ASAP3 mRNA表達水平，Western印跡法檢測肝癌細胞株MHCC97H細胞ASAP3蛋白表達強度，鑒定ASAP3-siRNA表達載體的功能；MTT法檢測細胞增殖和粘附率，流式細胞術檢測細胞凋亡，細胞劃痕法檢測細胞遷移能力，Transwell小室法檢測細胞侵襲性；（3）構建和克隆ASAP3真核表達載體（pASAP3）；（4）將pASAP3真核表達載體瞬時轉染Hep3B肝癌細胞中；RT-PCR法檢測肝癌細胞株Hep3B細胞ASA

6、P3 mRNA表達水平，Western-Blot法檢測Hep3B細胞中ASAP3蛋白的表達水平，鑒定pASAP3真核表達載體的功能；MTT法檢測細胞增殖和粘附率，流式細胞術檢測細胞凋亡，細胞劃痕法檢測細胞遷移能力，Transwell小室法檢測細胞侵襲性。
　　主要結果：（1）構建的pASAP3-siRNA表達載體對MHCC97H表達ASAP3 mRNA的沉默效率約為67％，對ASAP3蛋白表達的抑制率也超過65％，對細胞增殖的抑制

7、率為42.03±4.36％。（2）pASAP3-siRNA轉染MHCC97H細胞48h后，凋亡率為13.88±1.74％，而在其他對照組中并無明顯凋亡出現；細胞接種60min后，pASAP3-siRNA轉染MHCC97H細胞的粘附率明顯降低，為26.89±6.39％，和其他對照組比較具有顯著性差異（P＜0.05）；轉染24h后，ASAP3-siRNA轉染細胞的劃痕愈合較慢(37.67±10.04％)，pASAP3-siRNA轉染MHCC

8、97H細胞的侵襲力下降，較前兩組明顯降低(P＜0.01)。（3）pASAP3真核表達載體對Hep3B表達ASAP3 mRNA的增加效率約為3倍，對ASAP3蛋白表達的增加率也接近2倍。（4）pASAP3轉染Hep3B細胞48h后，對細胞增殖的增加率為31.23±10.14％；細胞接種60min后，pASAP3轉染Hep3B細胞的粘附率明顯提高，為42.75±9.36％，和其他對照組比較具有顯著性差異（P＜0.01）；轉染24h后，pAS

9、AP3轉染細胞的創(chuàng)口愈合較快(16.37±5.28％)和其他對照組比較具有顯著性差異（P＜0.05）；pASAP3轉染Hep3B細胞的侵襲力增強，較對照組明顯增高(P＜0.01)。
　　結論：（1）ASAP3-siRNA真核表達載體轉染MHCC97H細胞中可有效降低ASAP3的mRNA和蛋白的表達水平；ASAP3-siRNA對MHCC97H細胞的增殖能力有抑制作用；可誘導MHCC97H細胞凋亡；還可明顯抑制其在細胞外基質上的粘附率

10、、向劃痕損傷區(qū)的遷移能力和體外侵襲能力；（2）ASAP3真核表達載體轉染Hep3B細胞中可有效增加ASAP3的mRNA和蛋白的表達水平；pASAP3增強Hep3B細胞的增殖能力；還可明顯增強其在細胞外基質上的粘附率、向劃痕損傷區(qū)的遷移能力和體外侵襲能力。本研究揭示，ASAP3可增強肝癌細胞的侵襲轉移潛能。后續(xù)工作擬在此基礎上，繼續(xù)研究ASAP3對HCC細胞作用的分子機制，找尋以ASAP3作為基因干預的靶點，對發(fā)現肝癌治療新策略、防止肝癌