環(huán)孢素A對(duì)小鼠自然流產(chǎn)模型妊娠預(yù)后的影響及其分子機(jī)制.pdf

1、環(huán)孢素A(CyclosporinA，CsA)自20世紀(jì)70年代應(yīng)用于臨床以來(lái)，作為免疫抑制劑發(fā)揮了極其重要的作用：是目前公認(rèn)的抑制移植后排斥反應(yīng)最為有效的藥物之一。CsA是一種具有親脂性的環(huán)狀多肽化合物，該藥能通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性地與細(xì)胞漿內(nèi)的環(huán)孢親和素(Cyclophilin)結(jié)合蛋白結(jié)合，從而顯示T淋巴細(xì)胞的抑制效應(yīng)，阻斷參與排斥反應(yīng)的體液和細(xì)胞效應(yīng)機(jī)制，防止排斥反應(yīng)的發(fā)生。而且其對(duì)某些自身免疫性疾病的治療亦已取得一定的療效。 正常生

2、理妊娠類似于同種異體移植，胚胎作為自然的同種移植物不受母體免疫排斥是免疫排斥現(xiàn)象的唯一例外，實(shí)際上反映了母體對(duì)胚胎的免疫耐受。而妊娠失敗多因母體對(duì)胚胎的免疫排斥所致。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，于孕早期(胚胎著床期)腹腔注射CsA，可恢復(fù)小鼠妊娠失敗模型母一胎界面Thl／Th2／Th3型細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平免疫調(diào)節(jié)的生理平衡，形成維持正常妊娠所需的Th2／3型免疫偏倚，并誘導(dǎo)外周免疫細(xì)胞對(duì)父系抗原的免疫耐受，使流產(chǎn)模型的妊娠預(yù)后達(dá)到正常妊娠水平[2]

3、；體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)CsA可刺激人早孕期滋養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)，并改變其細(xì)胞形態(tài)，使其遷移能力及侵襲性增強(qiáng)口】。顯然CsA在一定濃度范圍內(nèi)對(duì)母胎界面具有良好的調(diào)節(jié)作用。 本研究通過(guò)CsA作用于自然流產(chǎn)模型孕鼠，研究其對(duì)小鼠自然流產(chǎn)模型妊娠結(jié)局的影響及其對(duì)母胎界面及外周的免疫耐受的誘導(dǎo)，并進(jìn)一步解析其分子機(jī)制，為反復(fù)自然流產(chǎn)等妊娠疾患的治療提供新線索。 第一部分 環(huán)孢素A對(duì)小鼠自然流產(chǎn)模型妊娠結(jié)局及母胎界面協(xié)同刺激分子表達(dá)的影響

4、目的：探討環(huán)孢素A對(duì)小鼠自然流產(chǎn)模型妊娠預(yù)后及母胎界面協(xié)同刺激分子表達(dá)的影響。 方法：將雌性CBA／J小鼠分別與雄性DBA／2小鼠和雄性BALB／c小鼠以2：1合籠交配建立小鼠自然流產(chǎn)模型和正常妊娠模型[7]，見(jiàn)陰栓日為妊娠第0天。于孕第4天給予CBA／J孕鼠單次灌服環(huán)孢素A，按照給藥劑量分為四組，分別為0mg／kg組(對(duì)照組)，0．1mg／kg組，lmg／kg組，10mg／kg組。正常妊娠模型組未給藥。孕14天計(jì)數(shù)各組CBA／

5、J孕鼠的胚胎吸收率。并采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR方法檢測(cè)孕鼠第9天及第14天母胎界面協(xié)同刺激分子的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平。 結(jié)果：未處理CBA／JxDBA／2孕鼠孕第14天的胚胎吸收率為28．00％，與文獻(xiàn)報(bào)道20％-30％的自然胚胎吸收率相符。而環(huán)孢素A處理組的小鼠胚胎吸收率分別為14．00％(0．1mg／kg)，10．47％(1mg／kg)，15．30％(10mg／kg)。與自然流產(chǎn)模型組相比，用0．1mg／kg，lmg／kg，10mg

6、／kg環(huán)孢素A處理組的胚胎吸收率顯著下降(P

7、．0947~0．0147，明顯低于自然流產(chǎn)模型孕鼠；而CTLA-4的表達(dá)水平則明顯高于自然流產(chǎn)模型孕鼠，比值為12．210~2．564和34．0599~6．7963。應(yīng)用環(huán)孢素A后，各組孕鼠母胎界面CD28、CD80、CD86的表達(dá)水平與自然流產(chǎn)模型孕鼠相比比值小于1，均有所降低；而CTLA一4的表達(dá)水平與自然流產(chǎn)模型孕鼠相比比值大于1，明顯升高。 結(jié)論：正常妊娠模型孕鼠母胎界面CD28,CD80,CD86的轉(zhuǎn)錄水平明顯低于自然

8、流產(chǎn)模型孕鼠，CTLA-4的轉(zhuǎn)錄水平則高于自然流產(chǎn)模型孕鼠，從而抑制T細(xì)胞活化，誘導(dǎo)免疫耐受，進(jìn)而可影響妊娠結(jié)局。環(huán)孢素AA可通過(guò)調(diào)節(jié)母胎界面協(xié)同刺激信號(hào)的表達(dá)從而誘導(dǎo)自然流產(chǎn)模型孕鼠對(duì)胚胎的免疫耐受從而改善妊娠結(jié)局。 第二部分 環(huán)孢素A對(duì)自然流產(chǎn)模型母胎界面THl／TH2型細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)作用 目的：探討環(huán)孢素A(CyclosporinA，CsA)對(duì)自然流產(chǎn)模型孕鼠母胎界面Thl／Th2型細(xì)胞因子的調(diào)控作用。 方

9、法：于孕第9天及第14天分別處死各組CBA／J孕鼠，以ELISA方法檢測(cè)母胎界面IL-4、IL．10、IFN-~、TNF-a、TGF-β細(xì)胞因子的表達(dá)水平；并用流式細(xì)胞術(shù)分析母胎界面滋養(yǎng)細(xì)胞分泌IL-10和IFN-y的情況。 結(jié)果：胚胎著床期應(yīng)用CsA后能夠顯著增加自然流產(chǎn)模型孕第9、14天母一胎界面Th2型細(xì)胞因子1L-4、IL-10和TGF-β的表達(dá)(P<0．05)；并且能夠顯著下調(diào)自然流產(chǎn)模型孕第9、14天母一胎界面IFN

10、-~和TNF-c~的表達(dá)(P

11、細(xì)胞因子(TNF-tx、IFNw)表達(dá)水平降低，母一胎界面局部趨向Th2型偏倚。從而誘導(dǎo)母一胎免疫耐受，使流產(chǎn)模型的妊娠預(yù)后達(dá)到正常妊娠水平。 第三部分 環(huán)孢素A對(duì)自然流產(chǎn)模型孕鼠外周調(diào)節(jié)性T細(xì)胞亞群的調(diào)節(jié) 目的：探討CsA對(duì)自然流產(chǎn)模型孕鼠外周調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的調(diào)控作用。 方法：流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)孕鼠脾臟CD4+CD25+T細(xì)胞比例及孕鼠脾臟CD4+CD25+FOXp3+T細(xì)胞比例。 結(jié)果：(1)自然流產(chǎn)模型

12、CBAJJ孕鼠孕第14天脾細(xì)胞CD4+CD25+T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例為9．21％；而環(huán)孢素A處理組的CBA／J孕鼠脾細(xì)胞CD4+CD25+T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例分別為14．23％(O．1mg／kg)，15．10％(1me／kg)，14．18％(10mg／kg)，與自然流產(chǎn)模型(對(duì)照組)相比較，各組均顯著增高(P<0．05)。(2)正常妊娠模型CBA／J孕鼠孕第9天脾細(xì)胞CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的

13、比例為14．23％；自然流產(chǎn)妊娠模型CBA／J孕鼠孕第9天脾細(xì)胞CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞占CD礦T細(xì)胞的比例為7．91％；環(huán)孢素Almg／kg處理組的CBA／J孕鼠孕第9天脾細(xì)胞CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例為13．82％。與自然流產(chǎn)模型相比較，均顯著增高(P<0．05)。 結(jié)論：(D正常妊娠模型的CBA／J孕鼠孕第9天脾細(xì)胞CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例高于自

14、然流產(chǎn)模型孕鼠。(2)孕早期服用CsA可通過(guò)提高外周CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例，從而誘導(dǎo)母胎免疫耐受，降低自然流產(chǎn)模型的胚胎吸收率。 第四部分 環(huán)孢素A對(duì)自然流產(chǎn)模型早孕期細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)功能的影響 目的：探討環(huán)孢素A(CyclosporinA，CsA)對(duì)早孕期自然流產(chǎn)模型孕鼠細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)功能的調(diào)控作用。 方法：應(yīng)用硅化聚乙酰胺吡咯烷酮(Percoll)密度梯度離心法，分離純化早孕期小鼠細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)

15、胞，經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)和流式細(xì)胞術(shù)鑒定其純度；MTT比色法分析CsA對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞活力的影響；FCM分析應(yīng)用CsA后細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞PCNA表達(dá)的變化；AnnexinV-FITC／PI雙標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)分析CsA對(duì)細(xì)胞早期凋亡的影響；采用transwell法分析小鼠細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲能力的改變； 結(jié)果：(1)行免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定抗cytokeratin7陽(yáng)性、vimentin單克隆抗體陰性的滋養(yǎng)細(xì)胞純度達(dá)95％以上。(2)正常妊娠模型小鼠早孕期細(xì)

16、胞滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖活力及PCNA的表達(dá)明顯比自然流產(chǎn)模型小鼠強(qiáng)，而在著床期給予CsA處理后，自然流產(chǎn)模型的小鼠早孕期細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖活力和PCNA表達(dá)明顯增強(qiáng)，接近正常妊娠模型小鼠早孕期細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖活力。(3)正常妊娠模型小鼠早孕期細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞早期凋亡率大約為9．54％，自然流產(chǎn)模型小鼠AnnexinV-FITC+、PI一的比率(即早期凋亡率)為14．5％，提示正常妊娠模型小鼠早期凋亡細(xì)胞明顯比自然流產(chǎn)模型小鼠低，而在著床期給予C

17、sA處理后，自然流產(chǎn)模型的小鼠早孕期細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡率明顯降低為9．1％，接近正常妊娠模型小鼠早孕期細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞的表達(dá)水平。(4)正常妊娠模型小鼠早孕期細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞穿入下表面的細(xì)胞數(shù)明顯比自然流產(chǎn)模型小鼠多，而在著床期給予CsAlmg／kg處理后，自然流產(chǎn)模型的小鼠早孕期細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞穿入下表面的細(xì)胞數(shù)增多，說(shuō)明其侵襲能力增強(qiáng)。 結(jié)論：(1)著床期應(yīng)用CsA可抑制自然流產(chǎn)模型組小鼠細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞的早期凋亡及促進(jìn)其增殖。推測(cè)CsA對(duì)滋