環(huán)孢素A對小鼠自然流產(chǎn)模型妊娠預后的影響及其分子機制.pdf

1、環(huán)孢素A(CyclosporinA，CsA)自20世紀70年代應用于臨床以來，作為免疫抑制劑發(fā)揮了極其重要的作用：是目前公認的抑制移植后排斥反應最為有效的藥物之一。CsA是一種具有親脂性的環(huán)狀多肽化合物，該藥能通過競爭性地與細胞漿內(nèi)的環(huán)孢親和素(Cyclophilin)結合蛋白結合，從而顯示T淋巴細胞的抑制效應，阻斷參與排斥反應的體液和細胞效應機制，防止排斥反應的發(fā)生。而且其對某些自身免疫性疾病的治療亦已取得一定的療效。 正常生

2、理妊娠類似于同種異體移植，胚胎作為自然的同種移植物不受母體免疫排斥是免疫排斥現(xiàn)象的唯一例外，實際上反映了母體對胚胎的免疫耐受。而妊娠失敗多因母體對胚胎的免疫排斥所致。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，于孕早期(胚胎著床期)腹腔注射CsA，可恢復小鼠妊娠失敗模型母一胎界面Thl／Th2／Th3型細胞因子轉錄水平免疫調(diào)節(jié)的生理平衡，形成維持正常妊娠所需的Th2／3型免疫偏倚，并誘導外周免疫細胞對父系抗原的免疫耐受，使流產(chǎn)模型的妊娠預后達到正常妊娠水平[2]

3、；體外實驗證實CsA可刺激人早孕期滋養(yǎng)細胞生長，并改變其細胞形態(tài)，使其遷移能力及侵襲性增強口】。顯然CsA在一定濃度范圍內(nèi)對母胎界面具有良好的調(diào)節(jié)作用。 本研究通過CsA作用于自然流產(chǎn)模型孕鼠，研究其對小鼠自然流產(chǎn)模型妊娠結局的影響及其對母胎界面及外周的免疫耐受的誘導，并進一步解析其分子機制，為反復自然流產(chǎn)等妊娠疾患的治療提供新線索。 第一部分 環(huán)孢素A對小鼠自然流產(chǎn)模型妊娠結局及母胎界面協(xié)同刺激分子表達的影響

4、目的：探討環(huán)孢素A對小鼠自然流產(chǎn)模型妊娠預后及母胎界面協(xié)同刺激分子表達的影響。 方法：將雌性CBA／J小鼠分別與雄性DBA／2小鼠和雄性BALB／c小鼠以2：1合籠交配建立小鼠自然流產(chǎn)模型和正常妊娠模型[7]，見陰栓日為妊娠第0天。于孕第4天給予CBA／J孕鼠單次灌服環(huán)孢素A，按照給藥劑量分為四組，分別為0mg／kg組(對照組)，0．1mg／kg組，lmg／kg組，10mg／kg組。正常妊娠模型組未給藥。孕14天計數(shù)各組CBA／

5、J孕鼠的胚胎吸收率。并采用實時定量RT-PCR方法檢測孕鼠第9天及第14天母胎界面協(xié)同刺激分子的轉錄表達水平。 結果：未處理CBA／JxDBA／2孕鼠孕第14天的胚胎吸收率為28．00％，與文獻報道20％-30％的自然胚胎吸收率相符。而環(huán)孢素A處理組的小鼠胚胎吸收率分別為14．00％(0．1mg／kg)，10．47％(1mg／kg)，15．30％(10mg／kg)。與自然流產(chǎn)模型組相比，用0．1mg／kg，lmg／kg，10mg

6、／kg環(huán)孢素A處理組的胚胎吸收率顯著下降(P

7、．0947~0．0147，明顯低于自然流產(chǎn)模型孕鼠；而CTLA-4的表達水平則明顯高于自然流產(chǎn)模型孕鼠，比值為12．210~2．564和34．0599~6．7963。應用環(huán)孢素A后，各組孕鼠母胎界面CD28、CD80、CD86的表達水平與自然流產(chǎn)模型孕鼠相比比值小于1，均有所降低；而CTLA一4的表達水平與自然流產(chǎn)模型孕鼠相比比值大于1，明顯升高。 結論：正常妊娠模型孕鼠母胎界面CD28,CD80,CD86的轉錄水平明顯低于自然

8、流產(chǎn)模型孕鼠，CTLA-4的轉錄水平則高于自然流產(chǎn)模型孕鼠，從而抑制T細胞活化，誘導免疫耐受，進而可影響妊娠結局。環(huán)孢素AA可通過調(diào)節(jié)母胎界面協(xié)同刺激信號的表達從而誘導自然流產(chǎn)模型孕鼠對胚胎的免疫耐受從而改善妊娠結局。 第二部分 環(huán)孢素A對自然流產(chǎn)模型母胎界面THl／TH2型細胞因子的調(diào)節(jié)作用 目的：探討環(huán)孢素A(CyclosporinA，CsA)對自然流產(chǎn)模型孕鼠母胎界面Thl／Th2型細胞因子的調(diào)控作用。 方

9、法：于孕第9天及第14天分別處死各組CBA／J孕鼠，以ELISA方法檢測母胎界面IL-4、IL．10、IFN-~、TNF-a、TGF-β細胞因子的表達水平；并用流式細胞術分析母胎界面滋養(yǎng)細胞分泌IL-10和IFN-y的情況。 結果：胚胎著床期應用CsA后能夠顯著增加自然流產(chǎn)模型孕第9、14天母一胎界面Th2型細胞因子1L-4、IL-10和TGF-β的表達(P<0．05)；并且能夠顯著下調(diào)自然流產(chǎn)模型孕第9、14天母一胎界面IFN

10、-~和TNF-c~的表達(P

11、細胞因子(TNF-tx、IFNw)表達水平降低，母一胎界面局部趨向Th2型偏倚。從而誘導母一胎免疫耐受，使流產(chǎn)模型的妊娠預后達到正常妊娠水平。 第三部分 環(huán)孢素A對自然流產(chǎn)模型孕鼠外周調(diào)節(jié)性T細胞亞群的調(diào)節(jié) 目的：探討CsA對自然流產(chǎn)模型孕鼠外周調(diào)節(jié)性T細胞的調(diào)控作用。 方法：流式細胞技術檢測孕鼠脾臟CD4+CD25+T細胞比例及孕鼠脾臟CD4+CD25+FOXp3+T細胞比例。 結果：(1)自然流產(chǎn)模型

12、CBAJJ孕鼠孕第14天脾細胞CD4+CD25+T細胞占CD4+T細胞的比例為9．21％；而環(huán)孢素A處理組的CBA／J孕鼠脾細胞CD4+CD25+T細胞占CD4+T細胞的比例分別為14．23％(O．1mg／kg)，15．10％(1me／kg)，14．18％(10mg／kg)，與自然流產(chǎn)模型(對照組)相比較，各組均顯著增高(P<0．05)。(2)正常妊娠模型CBA／J孕鼠孕第9天脾細胞CD4+CD25+Foxp3+T細胞占CD4+T細胞的

13、比例為14．23％；自然流產(chǎn)妊娠模型CBA／J孕鼠孕第9天脾細胞CD4+CD25+Foxp3+T細胞占CD礦T細胞的比例為7．91％；環(huán)孢素Almg／kg處理組的CBA／J孕鼠孕第9天脾細胞CD4+CD25+Foxp3+T細胞占CD4+T細胞的比例為13．82％。與自然流產(chǎn)模型相比較，均顯著增高(P<0．05)。 結論：(D正常妊娠模型的CBA／J孕鼠孕第9天脾細胞CD4+CD25+Foxp3+T細胞占CD4+T細胞的比例高于自

14、然流產(chǎn)模型孕鼠。(2)孕早期服用CsA可通過提高外周CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞比例，從而誘導母胎免疫耐受，降低自然流產(chǎn)模型的胚胎吸收率。 第四部分 環(huán)孢素A對自然流產(chǎn)模型早孕期細胞滋養(yǎng)細胞生物學功能的影響 目的：探討環(huán)孢素A(CyclosporinA，CsA)對早孕期自然流產(chǎn)模型孕鼠細胞滋養(yǎng)細胞生物學功能的調(diào)控作用。 方法：應用硅化聚乙酰胺吡咯烷酮(Percoll)密度梯度離心法，分離純化早孕期小鼠細胞滋養(yǎng)細

15、胞，經(jīng)免疫細胞化學和流式細胞術鑒定其純度；MTT比色法分析CsA對滋養(yǎng)細胞活力的影響；FCM分析應用CsA后細胞滋養(yǎng)細胞PCNA表達的變化；AnnexinV-FITC／PI雙標記流式細胞術分析CsA對細胞早期凋亡的影響；采用transwell法分析小鼠細胞滋養(yǎng)細胞侵襲能力的改變； 結果：(1)行免疫細胞化學鑒定抗cytokeratin7陽性、vimentin單克隆抗體陰性的滋養(yǎng)細胞純度達95％以上。(2)正常妊娠模型小鼠早孕期細

16、胞滋養(yǎng)細胞的增殖活力及PCNA的表達明顯比自然流產(chǎn)模型小鼠強，而在著床期給予CsA處理后，自然流產(chǎn)模型的小鼠早孕期細胞滋養(yǎng)細胞的增殖活力和PCNA表達明顯增強，接近正常妊娠模型小鼠早孕期細胞滋養(yǎng)細胞的增殖活力。(3)正常妊娠模型小鼠早孕期細胞滋養(yǎng)細胞早期凋亡率大約為9．54％，自然流產(chǎn)模型小鼠AnnexinV-FITC+、PI一的比率(即早期凋亡率)為14．5％，提示正常妊娠模型小鼠早期凋亡細胞明顯比自然流產(chǎn)模型小鼠低，而在著床期給予C

17、sA處理后，自然流產(chǎn)模型的小鼠早孕期細胞滋養(yǎng)細胞凋亡率明顯降低為9．1％，接近正常妊娠模型小鼠早孕期細胞滋養(yǎng)細胞的表達水平。(4)正常妊娠模型小鼠早孕期細胞滋養(yǎng)細胞穿入下表面的細胞數(shù)明顯比自然流產(chǎn)模型小鼠多，而在著床期給予CsAlmg／kg處理后，自然流產(chǎn)模型的小鼠早孕期細胞滋養(yǎng)細胞穿入下表面的細胞數(shù)增多，說明其侵襲能力增強。 結論：(1)著床期應用CsA可抑制自然流產(chǎn)模型組小鼠細胞滋養(yǎng)細胞的早期凋亡及促進其增殖。推測CsA對滋