miR-16促進心肌微環(huán)境誘導的骨髓間充質(zhì)干細胞向心肌表型細胞分化.pdf

1、目的:利用與新生Sprague-Dawley(SD)大鼠心肌細胞非接觸共培養(yǎng)法誘導人骨髓間充質(zhì)干細胞(humanbonemarrow-derivedmesenchymalstemcells,hBM-MSCs)向心肌表型(Cardiacphenotypiccells,CPs)細胞分化,檢測hBM-MSCs與Cps中微小RNA(microRNAs,miRNAs)表達譜差異,篩選誘導分化前后細胞差異性表達的miRNAs,篩選可以誘導hBM-M

2、SCs向心肌表型分化的miRNAs,并研究其誘導分化的分子機制。
　　方法:(1)采用骨髓直接貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)hBM-MSCs。觀察原代及傳代細胞的形態(tài)及增殖特點,采用流式細胞術(shù)檢測細胞表面標志物及誘導成脂分化等方法鑒定分離培養(yǎng)的hBM-MSCs。(2)用體外模擬心肌微環(huán)境,即利用非接觸共培養(yǎng)的原代新生SD大鼠心肌細胞(neonatalratventricularcardiomyocytes,NRVCs)誘導hBM-MSCs向C

3、ps分化。(3)利用miRNAs表達譜芯片檢測hBM-MSCs及Cps的miRNAs表達譜,篩選差異性表達的miRNAs。(4)用實時定量PCR的方法,驗證芯片中上調(diào)表達的miRNAs。(5)用非接觸共培養(yǎng)方法驗證miRNA促hBM-MSCs向心肌表型細胞分化的作用,用PCR、實時定量PCR、western-bloting、流式細胞術(shù)等方法研究miRNA誘導干細胞分化的分子機制。
　　結(jié)果:(1)經(jīng)骨髓貼壁法分離所得到細胞,外形呈

4、長梭形,普通光鏡下單個細胞核,核質(zhì)比較大;用流式細胞術(shù)檢測細胞表面標志物:CD29和CD44高表達,而CD34和CD45表達水平很低。(2)采用Transwell六孔板共培養(yǎng)體系:上層小室接種NRVCs,下層小室接種hBM-MSCs,共培養(yǎng)后可以在Cps中檢測到GATA4、Nkx2.5等心肌特異性基因顯著上調(diào)表達。(3)利用miRNA芯片技術(shù)檢測hBM-MSCs和Cps中的miRNA表達譜,在Cps中上調(diào)表達的miRNAs(上調(diào)表達倍數(shù)

5、大于兩倍)有5個:hsa-miR-16、hsa-let-7e、hsa-miR-138、hsa-let-7a、hsa-miR-524。(4)用實時定量PCR技術(shù)對4個miRNAs:hsa-miR-16、hsa-let-7e、hsa-miR-138、hsa-miR-524進行驗證,與hBM-MSCs組相比,Cps組中4個miRNAs前體的表達均顯著上調(diào)。(5)在心肌細胞微環(huán)境中,過表達miR-16能顯著上調(diào)hBM-MSC中GATA4、Nkx

6、2.5、MEF2C和CTnI等心肌特異性基因的表達。(6)miR-16能促進心肌微環(huán)境中的hBM-MSCs向CPs分化,可能是通過調(diào)控CCND1,CCND2和CDK6的表達并阻滯hBM-MSCs細胞周期于G1期來實現(xiàn)的。
　　結(jié)論:(1)經(jīng)骨髓直接貼壁法分離所得到的細胞為純度較高的人骨髓間充質(zhì)干細胞。(2)體外模擬心肌微環(huán)境可誘導hBM-MSCs向Cps分化;hBM-MSCs向Cps分化前后的miRNAs表達譜發(fā)生變化,提示差異表