脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化的分子機(jī)制研究.pdf

1、[目的]：
　　1.將SD大鼠心肌細(xì)胞(CMs)與脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(ASCs)共培養(yǎng)，以誘導(dǎo)ASCs分化為心肌樣細(xì)胞。
　　2.研究ASCs向心肌樣細(xì)胞分化的具體分子機(jī)制，探討Notch信號(hào)通路分子Notch1和Jagged1在分化過程中的作用。
　　3.加用DAPT（阻斷Notch信號(hào)通路的γ-secretase抑制劑），觀察ASCs分化為心肌樣細(xì)胞的比例是否下降或者不轉(zhuǎn)化，以證明Notch信號(hào)通路在ASCs增殖和分

2、化為心肌樣細(xì)胞過程中發(fā)揮著重要的靶向調(diào)控作用。
　　[方法]：
　　1.大鼠ASCs的分離與培養(yǎng)
　　采集SD大鼠腹股溝脂肪組織，采用膠原酶消化法分離、培養(yǎng)ASCs，觀察ASCs增殖、傳代和復(fù)蘇情況，并采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行ASCs鑒定（分析其表面抗原CD29、CD44、CD31、CD45的表達(dá)水平），并誘導(dǎo)ASCs向成骨、成脂方向分化，以鑒定其分化能力;
　　2.CMs的分離與培養(yǎng)
　　收集1～3d SD大鼠

3、乳鼠的心尖組織，進(jìn)行酶消化并差速貼壁法分離純化出乳鼠CMs，觀察其活性和生長(zhǎng)特點(diǎn)，并進(jìn)行鑒定（免疫熒光檢測(cè)cTnⅠ和connexin43的表達(dá)）;
　　3.ASCs與CMs共培養(yǎng)
　　用CD29標(biāo)記第4代ASCs后，將其與CMs共培養(yǎng)，觀察其生長(zhǎng)情況，并進(jìn)行cTnⅠ的免疫熒光檢測(cè)以鑒定ASCs是否轉(zhuǎn)化為心肌樣細(xì)胞;將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第4代ASCs隨機(jī)分為3組，一組與心肌細(xì)胞混合培養(yǎng)為實(shí)驗(yàn)組，一組加入DAPT后與心肌細(xì)胞混合培養(yǎng)

4、為阻斷組，一組單獨(dú)培養(yǎng)做對(duì)照組;
　　4.qRT-PCR、Western Blot檢測(cè)各組Notch信號(hào)通路分子Notch1和Jagged1表達(dá);
　　[結(jié)果]：
　　1.成功分離、培養(yǎng)ASCs，第3代ASCs鑒定:CD29表達(dá)率97.78％±2.21％，CD31表達(dá)率為8.26％±1.47％，CD44表達(dá)率為43.90％±1.84％， CD45表達(dá)率為4.23％±1.91％，第3～5代ASCs表面抗原無(wú)明顯差異(p＞

5、0.05)，對(duì)照組陰性表達(dá);
　　2.ASCs成脂、成骨誘導(dǎo)成功，成脂誘導(dǎo)細(xì)胞可見紅色圓形脂滴，成骨誘導(dǎo)可見玫瑰紅色鈣結(jié)節(jié);
　　3.成功分離、培養(yǎng)CMs，其cTnⅠ蛋白（呈紅色熒光）和connexin43蛋白（綠色熒光）皆為陽(yáng)性表達(dá); ASCs與CMs共培養(yǎng)后，呈現(xiàn)ASCs向心肌樣細(xì)胞分化，成功分化的帶有CD29標(biāo)記的ASCs細(xì)胞cTnⅠ蛋白（呈紅色熒光）為陽(yáng)性表達(dá)，而對(duì)照組則為陰性;
　　4.qRT-PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

6、組Notch1和Jagged1的mRNA表達(dá)水平，較阻斷組或?qū)φ战M明顯增加(p＜0.05)，阻斷組較對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05);WesternBlot檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組Notch1和Jagged1表達(dá)較阻斷組或?qū)φ战M增加(p＜0.05);阻斷組較對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05);阻斷組ASCs分化為心肌樣細(xì)胞的比例較對(duì)照組明顯下降;帶有CD29標(biāo)記的ASCs的cTnⅠ鑒定基本呈陰性。
　　[結(jié)論]：
　　1.SD大鼠ASC