利用siRNA抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞c-Met基因的研究.pdf

1、背景和目的:
　　 胃癌是世界范圍內(nèi)最常見的消化道惡性腫瘤,具有發(fā)病率高、死亡率高、早期診斷率低,生存率低等特點(diǎn)。目前主要對(duì)于進(jìn)展期胃癌治療以手術(shù)切除為主,化療為輔,但存在效率低,復(fù)發(fā)率高,易耐藥等諸多問題。因此,尋求副反應(yīng)更小治療效果更好的方法勢(shì)在必行。隨著對(duì)胃癌及發(fā)病機(jī)制研究的逐漸深入,人們認(rèn)識(shí)到胃癌的發(fā)展是一個(gè)多步驟、多階段及多因素參與的疾病,而癌基因的激活與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),抑制癌基因的突變、過度表達(dá)可以防止正常細(xì)

2、胞向惡性轉(zhuǎn)化,從而達(dá)到治療腫瘤的目的。因此,基因水平治療成為近年來胃癌治療關(guān)注的熱點(diǎn)。
　　 原癌基因c-Met所編碼的蛋白質(zhì)屬酪氨酸激酶(protein-tyrosine kinases,PTKs)家族的一員,是肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Hepatocyte Growth Factor,HGF)特異性受體。研究發(fā)現(xiàn),c-Met在胃癌中持續(xù)異常高表達(dá),異常表達(dá)的c-Met激活下游效應(yīng)分子導(dǎo)致誘發(fā)腫瘤細(xì)胞增殖分裂,粘附浸潤(rùn),促進(jìn)腫瘤血管形成

3、,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移浸潤(rùn)中具有重要作用。
　　 RNA干擾(RNA interference,RNAi)是將與靶基因的mRNA同源互補(bǔ)的雙鏈RNA(dsRNA)導(dǎo)入細(xì)胞,能特異性地降解該mRNA,從而產(chǎn)生相應(yīng)的功能表型缺失,屬于轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默(post-transcriptional gene silencePTGS)。RNA干擾(RNAi)技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一項(xiàng)新技術(shù),可特異而有效地阻斷目的基因的表達(dá),在細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)

4、致與其序列同源的mRNA分子發(fā)生特異性降解,從而達(dá)到腫瘤治療的目的。與傳統(tǒng)的基因療法相比,RNA干擾其特有的高效、特異、副作用小、操作簡(jiǎn)單等突出的優(yōu)勢(shì),成為基因治療的新策略。
　　 本實(shí)驗(yàn)利用RNA干擾技術(shù)抑制胃癌細(xì)胞株SGC-7901中c-Met基因的表達(dá),比較轉(zhuǎn)染前后c-Met基因mRNA表達(dá)水平、蛋白表達(dá)水平以及胃癌細(xì)胞增殖能力的變化,探討采用RNA干擾技術(shù)沉默c-Met基因表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞生物學(xué)的影響,為胃癌治療提供新的方

5、法和思路。
　　 材料和方法:
　　 1.人胃癌SGC-7901細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫,置于含有10％胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液中,37℃,5％CO2,濕度80％環(huán)境中培養(yǎng)。根據(jù)人c-Met基因的cDNA編碼序列,由上海吉瑪制藥有限公司設(shè)計(jì)并合成三個(gè)靶基因序列。
　　 2.利用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000介導(dǎo),將特異性c-Met-siRNA轉(zhuǎn)染入人胃癌細(xì)胞株SGC-7

6、901細(xì)胞,并設(shè)置陰性對(duì)照組和空載體組,及空白對(duì)照組。
　　 3.轉(zhuǎn)染48小時(shí)后,倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的形態(tài)學(xué)變化利用RT-PCR方法檢測(cè)SGC-7901細(xì)胞中的c-Met mRNA表達(dá)變化；Western blot方法檢測(cè)蛋白表達(dá)改變情況；MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況的變化,并繪出對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。
　　 結(jié)果:
　　 1.RT-PCR和Western blot方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染c-Met-siRNA

7、后SGC-7901細(xì)胞中c-Met的mRNA和蛋白表達(dá)均較對(duì)照組顯著降低(p<0.05)。
　　 2.倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),在轉(zhuǎn)染后48小時(shí),轉(zhuǎn)染c-Met-siRNA組,細(xì)胞增殖明顯減少,細(xì)胞數(shù)量減少,細(xì)胞聚集情況明顯抑制。
　　 3.MTT結(jié)果顯示,24、48、72和96小時(shí)四個(gè)時(shí)間段細(xì)胞的OD值,實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組比較均有差異(p<0.05),實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖能力明顯減弱,且效果在48小時(shí)最顯著,此時(shí)其增

8、殖能力抑制率>50％。
　　 結(jié)論:
　　 1.利用陽離子脂質(zhì)體LipofectamineTM2000介導(dǎo),使c-Met-siRNA成功轉(zhuǎn)染入人胃癌SGC-7901細(xì)胞。
　　 2.c-Met-siRNA轉(zhuǎn)染入人胃癌SGC-7901細(xì)胞后,能有效抑制各實(shí)驗(yàn)組中c-Met基因mRNA及蛋白的表達(dá),并有效抑制人胃癌SGC-7901細(xì)胞的增殖能力。
　　 3.RNA干擾技術(shù)成功抑制c-Met基因在胃癌SGC-7