蜱體伯氏疏螺旋體分離鑒定及萊姆病ELISA檢測方法的建立.pdf

1、萊姆病是經硬蜱傳播的，由伯氏疏螺旋體引起的人畜共患病。該病呈世界性分布，目前，全球估計年發(fā)病人數約為30萬人左右，且有不斷增長的趨勢。在美國，萊姆病有“第二艾滋病”之稱，1992年世界衛(wèi)生組織將此病列為重點防治對象，現已成為全球性的公共衛(wèi)生問題之一。近年來，對萊姆病病原生物學、致病機理、流行病學、診斷及綜合防治方面的研究已取得了一定的成果，但由于伯氏疏螺旋體抗原結構的復雜性以及萊姆病的臨床癥狀的多樣性，使得該病的確診較困難。另外，萊姆病

2、作為一種新發(fā)病，在我國對其傳播媒介蜱的種類尚未完全明晰，同時關于其病原體的基因型及分類地位均未闡明，這給診斷和防治該病帶來極大的挑戰(zhàn)。因此，闡明其傳播媒介的種類和病原體的分類地位將有助于我們建立高效、快速診斷手段，合理地開展該病的防治工作。
　　 本文主要在萊姆病病原體的分類學及其診斷學兩個方面進行探索。(1)對源于我國部分林區(qū)采集的亞洲璃眼蜱(Hyalomma asiaticum)、長角血蜱(Haemaphysalis lon

3、gicornis)等多種蜱種進行伯氏疏螺旋體的檢測；(2)對所分離的螺旋體進行分型研究；(3)對所獲得的伯氏疏螺旋體鞭毛基因及鞭毛基因的保守區(qū)段進行克隆，并在體外表出達伯氏疏螺旋體鞭毛基因保守區(qū)段，用保守區(qū)段重組蛋白作為萊姆病的診斷抗原，建立萊姆病ELISA診斷方法。
　　 第一部分，用套式PCR方法擴增蜱體內的伯氏疏螺旋體鞭毛基因，對采自新疆、青島和延邊等地區(qū)的亞洲璃眼蜱和長角血蜱及蜱腸培養(yǎng)物進行檢測，對PCR所擴增目的基因片

4、段進行測序，測序結果經GenBank中的blast比對分析。采用BSK-H固體培養(yǎng)基分離培養(yǎng)技術，從蜱腸內分離和純化伯氏疏螺旋體單克隆，并采用分子生物學方法對分離到的單克隆菌落進行分型。首先對新疆地區(qū)的亞洲璃眼蜱和鐮形扇頭蜱在顯微鏡下進行解剖，取其腸，用BSK-H液體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，收集蜱腸培養(yǎng)物，提取其基因組DNA，采用套式PCR方法擴增鞭毛基因。然后，對經鑒定含有伯氏螺旋體的腸培養(yǎng)物，利用BSK-H固體培養(yǎng)分離技術，對其進行分離純化

5、，建立了一種快速而方便的分離伯氏疏螺旋體培養(yǎng)方法。最后，應用recA基因和5S-23S間區(qū)基因作為分型的靶基因對分離到的伯氏疏螺旋體單克隆進行初步分型，recA基因是與伯氏疏螺旋體進化相關的基因，其GC含量的變化可以通過熒光定量PCR的熔解曲線很容易的反映出來，根據此特性，用定量熒光PCR熔解曲線對分離到的螺旋體單克隆進行初步分型。經初步分型，本次從亞洲璃眼蜱中分離到伽氏疏螺旋體、狹義的伯氏疏螺旋體等菌株。同時為進一步確定螺旋體基因型，

6、對其5S-23S間區(qū)進行PCR擴增，并對擴增產物進行測序，根據其測序結果進一步分型。伯氏疏螺旋體單克隆的分離及初步分型的研究，為萊姆病病原生物學研究奠定了基礎。
　　 第二部分，對萊姆病血清學診斷技術進行了研究。該研究用重組伯氏疏螺旋體鞭毛基因蛋白作為診斷抗原，建立萊姆病ELISA診斷方法。本研究利用生物工程方法，選取鞭毛基因的氨基酸序列的第131-266區(qū)段作為目的片段，對其克隆，連接到PGEX-4T-1表達載體上，構建保守基

7、因片段的重組質粒，然后轉化到感受態(tài)細胞BL21中，原核表達伯氏疏螺旋體鞭毛基因抗原性和保守性較強的區(qū)段的平截性蛋白，用GST.BIND純化系統純化伯氏疏螺旋體鞭毛基因重組蛋白，所純化的蛋白用作診斷抗原；同時將伯氏疏螺旋體分別接種小鼠和兔，兩周后收集血清，用上述診斷抗原鑒定，發(fā)現經感染的小鼠和兔血清均為陽性血清，建立了敏感性和特異性較高的ELISA診斷方法。此方法為解決萊姆病診斷困難、難以確診提供了一種有益的借鑒，特別為萊姆病早期的診斷提