重組DNA疫苗治療大鼠脊髓損傷的實驗研究.pdf

1、研究背景：
　　 傳統觀點認為,成年哺乳動物中樞神經系統(Central nerve system,CNS)軸突損傷后不能再生,造成的功能缺失亦不可逆。近年研究表明,CNS損傷后,微環(huán)境中的軸突再生抑制因子抑制了神經軸突的再生修復。目前已經明確的軸突再生抑制因子有髓磷脂相關糖蛋白(myelin-associated glycoprotein,MAG)、少突膠質細胞髓磷脂糖蛋白(oligodendrocyte-myelin gly

2、coprotein,OMgp)、腱糖蛋白(tenascin-R,TN-R)和Nogo-A。針對去除和中和軸突再生抑制因子從而促進受損傷神經軸突再生和功能修復,成為神經醫(yī)學領域關注的焦點,并取得了一定進展,但以往針對單一抑制因子的治療研究效果不十分理想。本課題組在前期研究工作中,構建了一種編碼MAG、TN-R和Nogo-A的重組DNA疫苗,旨在最大程度中和相對關鍵的抑制因子、促進CNS損傷后修復與再生。實驗表明,接種了這種重組DNA疫苗的

3、正常大鼠,可在其血清中檢測到特異性的重組融合蛋白抗體；對接受疫苗免疫的大鼠制作脊髓背側半橫斷損傷模型,可觀察到受損傷的皮質脊髓束(corticospinal tract,CST)纖維獲得了長距離的再生。但是在臨床實踐中,任何針對脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)的治療實際上都是在損傷發(fā)生之后才得以進行,而目前臨床上對于SCI的治療都是以盡可能保留殘余組織功能為宗旨、以進一步減少副損傷并積極進行康復治療為主要目標,尚

4、缺乏促進CNS損傷后軸突再生的有效治療策略。
　　 為方便后續(xù)臨床治療研究,本課題組在原有DNA疫苗的基礎上、進一步構建了一種針對更多抑制因子功能位點的重組DNA疫苗,它編碼MAG的Ig1-5結構域、TN-R的EGF-L結構域、OMgp的FN結構域、Nogo-A的N末端(Nogo-N)和66氨基酸胞外段(Nogo-66),并且采用腺病毒的骨架質粒pAdEasy作為載體,以便在后續(xù)可能進行的臨床實驗中包裝成腺病毒從而方便應用。在本

5、實驗中,我們對這種全新的重組DNA疫苗進行了免疫原性和安全性評估；并且以大鼠脊髓背側半橫斷損傷模型為研究對象,對該重組DNA疫苗在SCI后促進CST纖維再生的治療效果進行了綜合評價。
　　 第一部分 重組DNA疫苗的免疫原性和安全性研究
　　 目的：評估以腺病毒骨架質粒pAdEasy為載體,編碼CNS損傷后軸突再生抑制因子MAG的Ig1-5結構域、TN-R的EGF-L結構域、0Mgp的FN結構域、Nogo-A的N末端(N

6、ogo-N)和66氨基酸胞外段(Nogo-66)的重組DNA疫苗之免疫原性和安全性。
　　 方法:以重組DNA疫苗連續(xù)肌肉注射、免疫5周齡Lewis大鼠8周[16只Lewis大鼠雌、雄各半,隨機分為DNA疫苗注射組(Vaccine組)和空質粒注射組(pAdEasy組)兩組],1次/周,100μg/次；自第二周起,注射疫苗的同時自內眥采血并獲取血清,點雜交(Dot-blot)及ELISA法對大鼠血清中特異抗體進行定性和定量檢測。再

7、以重組DNA疫苗對8周齡雌性Lewis大鼠連續(xù)肌肉注射免疫12周(1次/周),觀察大鼠是否出現脫髓鞘病變的癥狀,取大鼠的脊髓組織,光鏡下觀察以固藍染色/甲酚紫染色及HE染色的脊髓組織,制作電鏡標本和電鏡下觀察；同時以實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmuneencephalomyelitis,EAE)模型大鼠的脊髓組織為陽性對照,正常大鼠為陰性對照,評價是否有脫髓鞘病變的出現。
　　 結果:在接受疫

8、苗注射4周后,大鼠血清內有針對融合蛋白的特異性抗體產生,6周后抗體效價可達到1:100萬；接受DNA疫苗免疫12周,大鼠從行為學上未見有自身免疫性腦脊髓膜炎的癥狀,視神經、腦干和脊髓內的皮質脊髓束形態(tài)學上均與正常大鼠無異,未見脫髓鞘的病理改變。
　　 結論:本實驗條件下,編碼軸突生長抑制分子Nogo-A、OMgp、TN-R和MAG的重組DNA疫苗在接種大鼠后能夠產生特異性的抗體,有良好的免疫原性且并未出現中樞神經系統脫髓鞘病變。

9、
　　 第二部分 重組DNA疫苗治療脊髓損傷的實驗研究
　　 目的：觀察重組DNA疫苗對脊髓背側半橫斷損傷模型大鼠的促皮質脊髓束神經軸突再生和功能修復療效。
　　 方法:8周齡雌性Lewis大鼠,體重200～220g,以2％戊巴比妥鈉40mg/Kg腹腔內注射麻醉,虹膜咬除器切除第T8-9椎板制作大鼠脊髓背側半橫斷損傷模型。實驗動物依造模后治療方法的不同,隨機分為4組(每組8只):①VV組:DNA疫苗(DNA Va

10、ccine)+免疫血清(Anti-sera)；②VC組:DNA疫苗+對照血清(Control sera)；③CC組:空質粒pAdEasy+對照血清；④Control組:制作模型后不予相關治療。手術時采用充滿了免疫血清的植入式膠囊滲透壓泵(MODEL,2ML4,2.5μL/h,28d),通過置于硬脊膜下的微導管以2.5μL/h的速度持續(xù)4周向鞘內注入免疫血清；同時在損傷后即肌注DNA疫苗,100μg/次,1次/周,持續(xù)8周。治療對照組(即

11、VC組、CC組)分別以正常血清代替免疫血清,以沒有攜帶疫苗所編碼基因片段的pAdEasy質粒代替DNA疫苗,給藥方式和時間相同。術后對大鼠依BBB評分進行行為學檢測。在對模型動物取材前2周,大鼠用10％生物素萄聚糖胺(biotin dextran amine,BDA,MW 10,000)溶液緩慢注入雙側的感覺運動區(qū)皮質內進行皮質脊髓束追蹤,ABC法對生物素標記的軸突進行顯色。取以損傷灶為中心長為3mm新鮮脊髓組織進行Western-bl

12、ot檢測,對TN-R、OMgp和生長相關蛋白(growth associated protein,GAP-43)進行半定量測定。
　　 結果:制作脊髓背側半橫斷損傷模型并同步治療到第8周時,各組大鼠BBB評分的分值分別為:VV組,13.33±1.37:VC組,6.50±0.55；CC組,7.00±0.89；Control組,6.33±1.03。其中VV組的BBB評分與對照組相比增高有顯著的統計學意義(P=0.000)；脊髓背側半

13、橫斷損傷后8周,經DNA疫苗和免疫血清聯合治療組(VV組)大鼠的皮質脊髓束可見大量BDA陽性標記的再生纖維穿過損傷灶,而VC,CC和Control組則幾乎未見有纖維再生的跡象,標記的纖維僅限于膠質瘢痕部位的近端。VV組每張切片上計數的BDA陽性標記再生軸突的平均數量(6.69±1.76)與Control組(1.02±1.06)相比,增多有顯著的統計學意義(P=0.000)。Western-blot檢測結果表明,損傷處的TN-R和OMgp