Tricellulin在鉛暴露誘導(dǎo)血-腦脊液屏障通透性改變中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、鉛作為一種生活中廣泛應(yīng)用但具有毒性的重金屬,能夠造成人體多個(gè)系統(tǒng)和器官功能紊亂和損傷,尤其對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)的損傷最為嚴(yán)重。兒童由于其發(fā)育、代謝的特點(diǎn),對(duì)鉛的神經(jīng)毒性尤為敏感,能夠嚴(yán)重影響兒童CNS發(fā)育,造成智力下降,認(rèn)知功能異常等。鉛神經(jīng)毒性的作用機(jī)制包括多個(gè)方面,近年來(lái)研究提示血腦屏障通透性改變?cè)阢U神經(jīng)毒性中的作用越來(lái)越引起人們的重視。
　　血腦屏障(blood-brain

2、barrier,BBB)、血-腦脊液屏障(blood-cerebrospinal fluid barrier,BCB)在維持大腦內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。BCB是血腦屏障的重要組成部分,位于腦室脈絡(luò)叢的血液和腦脊液之間,主要由脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞組成,能控制腦脊液的形成和運(yùn)輸,并限制血液中有害物質(zhì)進(jìn)入大腦。脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞之間形成的緊密連接是BCB的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),能有效的阻止有害物質(zhì)從細(xì)胞間隙中穿過(guò)。緊密連接主要由多種緊密連接蛋白組成,包括oc

3、cludin家族,claudin家族和JAM家族。近年來(lái),三細(xì)胞間緊密連接引起人們的廣泛重視。Tricellulin是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新的緊密連接蛋白,由于主要分布在三細(xì)胞間,簡(jiǎn)稱(chēng)TRIC。TRIC存在于三個(gè)上皮細(xì)胞的交界處,不僅是緊密連接的重要組成部分,而且在功能上與跨膜蛋白o(hù)ccludin能形成互補(bǔ)作用。TRIC的分布廣泛,但是其在脈絡(luò)叢細(xì)胞中的表達(dá)及功能尚未見(jiàn)報(bào)道。
　　BCB是鉛的重要作用靶點(diǎn)之一,鉛暴露能夠引起增加BCB

4、的通透性,從而導(dǎo)致腦內(nèi)鉛含量增加。鉛暴露改變BCB通透性的具體機(jī)制尚不完全明確,可能與鉛暴露引起脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞間緊密連接蛋白claudin-1的表達(dá)下降有關(guān),而TRIC是否在鉛誘導(dǎo)的BCB通透性改變中發(fā)揮作用尚不清楚。
　　【目的】
　　觀察TRIC在脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞中的表達(dá),探究TRIC在BCB中的作用;建立鉛誘導(dǎo) BCB通透性改變的細(xì)胞模型,觀察鉛對(duì)TRIC表達(dá)水平的影響,并探討TRIC在鉛誘導(dǎo)的BCB通透性改變中的作用及

5、調(diào)控機(jī)制,從microRNA(miRNA)的角度揭示鉛暴露對(duì)TRIC表達(dá)的影響,為進(jìn)一步闡明TRIC在BCB中的功能及其在鉛誘導(dǎo)BCB通透性改變機(jī)制中提供理論依據(jù)。
　　【方法】
　　1.采用免疫熒光染色、Western blot和PCR的方法檢測(cè)不同發(fā)育期SD仔鼠的脈絡(luò)叢細(xì)胞和體外培養(yǎng)不同時(shí)間的Z310細(xì)胞中TRIC的表達(dá)及定位情況。
　　2.利用Z310細(xì)胞建立體外BCB模型,進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染后,通過(guò)檢測(cè)跨膜內(nèi)皮

6、電阻(Transendothelial electrical resistance,TEER)和熒光葡聚糖(FITC-dextran)通透性檢測(cè)降低TRIC表達(dá)對(duì)屏障通透性的影響。
　　3.利用Z310細(xì)胞建立鉛暴露誘導(dǎo)體外BCB通透性改變模型,采用免疫熒光染色、Western blot、屏障通透性實(shí)驗(yàn)及轉(zhuǎn)染高表達(dá)質(zhì)粒等方法檢測(cè)TRIC在鉛誘導(dǎo)體外BCB通透性改變中的作用。
　　4.通過(guò)生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)調(diào)控TRIC的mic

7、roRNA。采用qRT-PCR等方法檢測(cè)鉛暴露后脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞內(nèi) TRIC相關(guān) microRNA的表達(dá)情況,并采用 Western blot、通透性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)相關(guān)microRNA對(duì)TRIC的表達(dá)調(diào)控及對(duì)BCB通透性的影響。
　　【結(jié)果】
　　1.TRIC在體內(nèi)、體外脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞中均有表達(dá),并參與BCB的形成
　　免疫熒光染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)TRIC在脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞存在表達(dá),主要在三細(xì)胞連接處分布,并且與occludin有共定位

8、現(xiàn)象。RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示,TRIC在脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞和永生化大鼠脈絡(luò)叢細(xì)胞Z310中均有表達(dá),并且隨著仔鼠的發(fā)育和培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),TRIC mRNA和蛋白表達(dá)呈逐漸升高趨勢(shì)。TEER和熒光葡聚糖通透性結(jié)果發(fā)現(xiàn),降低TRIC的表達(dá)可引起TEER下降至對(duì)照組的84％(P<0.05),葡聚糖通透性增加至對(duì)照組的1.5倍(P<0.05),提示TRIC在BCB通透性中發(fā)揮重要作用。
　　2.鉛暴露能降低TRIC的表

9、達(dá)和分布
　　通過(guò)加入5μM和10μM的醋酸鉛,利用Z310細(xì)胞建立鉛暴露誘導(dǎo)體外BCB通透性改變模型,Western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)鉛暴露72h后能顯著降低TRIC的蛋白表達(dá)（P<0.05);免疫熒光染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)鉛暴露后 TRIC在細(xì)胞間的分布明顯減少(P<0.05)。
　　3.高表達(dá)TRIC能抑制鉛暴露引起的體外BCB的損傷
　　TEER和FITC-dextran通透性實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),鉛暴露能引起體外BCB的通透性

10、增加;轉(zhuǎn)染高表達(dá)TRIC質(zhì)粒后可增加TRIC的蛋白表達(dá)水平,并且TRIC在三細(xì)胞間的分布也明顯增加;高表達(dá)TRIC能部分降低鉛暴露誘導(dǎo)的體外BCB通透性改變程度(P<0.05)。
　　4.miR-203可能通過(guò)調(diào)控TRIC蛋白,參與鉛誘導(dǎo)的BCB通透性改變
　　生物信息學(xué)預(yù)測(cè)顯示,miR-203可能是調(diào)控TRIC的microRNA;qRT-PCR結(jié)果顯示,鉛暴露能引起脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞和Z310細(xì)胞中 miR-203表達(dá)升高;加

11、入 miR-203 inhibitor能有效抑制miR-203的表達(dá)(P<0.05),并且降低miR-203的表達(dá)能部分抑制鉛誘導(dǎo)的TRIC蛋白表達(dá)下降(P<0.05),在一定程度上減輕鉛對(duì)體外BCB的損傷作用。
　　【結(jié)論】
　　1.體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)TRIC在脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞間存在表達(dá),且其蛋白含量隨發(fā)育不斷增加,提示TRIC參與BCB的緊密連接的形成;降低TRIC能影響B(tài)CB功能的正常發(fā)揮。
　　2.鉛暴露能引起

12、Z310細(xì)胞中TRIC蛋白表達(dá)下降并引起TRIC在細(xì)胞間分布減少;高表達(dá)TRIC后能夠在一定程度上降低鉛暴露引起的BCB通透性增加,提示TRIC可能在鉛誘導(dǎo)的BCB通透性增加中發(fā)揮重要作用。
　　3.生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)miR-203可能是調(diào)控TRIC的microRNA;鉛暴露能改變脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞中的miR-203的表達(dá),而抑制 miR-203的表達(dá)能有效減少鉛對(duì)TRIC蛋白表達(dá)的影響,并且在一定程度上抑制鉛暴露造成的BCB通透性改