內毒素脂多糖對血迷路屏障通透性的影響及其機制研究.pdf

1、分泌性中耳炎是臨床常見疾病之一，目前其發(fā)病原因及機制尚不十分清楚，被認為是多種因素造成的，包括細菌病毒感染等。脂多糖（Lipopolysaccharide， LPS）作為革蘭氏陰性細菌細胞壁中的一種成分，研究顯示它在分泌性中耳炎發(fā)病過程中起著重要作用，能夠在中耳腔觸發(fā)一系列炎癥反應，包括激活宿主的巨噬細胞，產(chǎn)生大量炎性介質和生物活性物質等。許多研究已經(jīng)證明脂多糖觸發(fā)的中耳炎癥產(chǎn)生大量的炎性因子還可通過圓窗或者卵圓窗感染耳蝸，引起內耳結構

2、和功能炎性改變，破壞內耳內環(huán)境穩(wěn)態(tài)的平衡。血管紋血迷路屏障（the intrastrial fluid–blood barrier）是血迷路屏障（blood-lybrinth barrier，BLB）的主要構成，雖然在調節(jié)血流量方面起著次要作用，但是在對于維持耳蝸靜息電位，調控離子轉運和維持內耳內環(huán)境穩(wěn)態(tài)發(fā)揮著重要作用。脂多糖是如何影響血管紋血迷路屏障的，其具體機制尚不十分清楚。本次試驗中，我們分別通過體內試驗和體外離體模型來研究脂多糖

3、對血迷路屏障通透性的影響及分子作用機制。
　　首先我們運用聚焦離子/電子雙束顯微電鏡（FIB/SEM）技術,獲取高清血管紋血迷路屏障的超微結構圖，發(fā)現(xiàn)血迷路屏障不僅有基質膜和內皮細胞(Endothial cell，EC)組成，還有大量的周細胞（Pericyte,PC）和血管旁定居的巨噬細胞樣黑色素細胞（ perivascular-resident macrophage-like melanocytes， PVM/M）。并運用先進的

4、VolRoverN軟件進行3D重建，重建的三維圖清晰地顯示三種細胞的位置關系，有助于我們更好地理解血迷路屏障結構。EC被緊密連接結合在一起，形成內耳阻礙大部分血源性物質進入內耳的第一道屏障，與EC緊密相連的 PC，形成第二道防線，對血迷路屏障的完整性起著非常重要作用。PVM/M，一種既具有黑色素細胞又具有巨噬細胞特性的復雜細胞類型，借助細長的胞漿偽足與血管壁緊密連接，形成了血-迷路屏障的又一道防線。我們原代培養(yǎng)血管紋EC、PC和PVM/

5、M，并利用其建立3D懸滴球體共培養(yǎng)模型，球體模型形成過程是細胞與細胞之間完全自發(fā)，自然的結合，不依靠任何外界支架的支持，更好地模擬了細胞的體內環(huán)境。并且我們成功建立了表達質粒載體的這三種細胞株，并進一步建立3D基質凝膠共培養(yǎng)模型，為后續(xù)實驗奠定基礎。
　　在體，我們首先運用免疫組織化學、冰凍切片、石蠟切片、活體‘血管-開窗’和血管滲漏試驗等方法研究脂多糖對小鼠血管紋血迷路屏障的影響，我們的研究結果顯示，LPS可引起血管滲漏。LPS

6、誘發(fā)的局部感染可以改變血管紋血迷路屏障的PC和PVM/M的形態(tài)和特性，影響血迷路屏障的完整性。進一步我們結合熒光實時定量多聚酶鏈反應(real-time fluorescence quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)、蛋白印跡(western blot)和透射電鏡(Transmission electron microscope,TEM

7、)等方法觀察LPS對血管紋血迷路屏障緊密連接相關蛋白的影響。結果表明，脂多糖可通過改變血管紋血迷路屏障組成細胞PC和PVM/M的形態(tài)和特性，調控緊密連接相關蛋白的表達，影響血管紋血迷路屏障的通透性。且與先前報道結果相一致，本研究結果顯示脂多糖可引起高頻聽力損失。
　　離體，我們利用原代培養(yǎng)血管紋EC建立EC單層培養(yǎng)模型，脂多糖處理不同時間，發(fā)現(xiàn)LPS處理組EC單層對小分子熒光物質FITC-dextran的滲透率較正常對照組明顯升高

8、，更進一步我們結合實時定量多聚酶鏈反應，in cell western，免疫細胞熒光等方法研究脂多糖對內皮細胞緊密連接蛋白表達的影響，與體內研究結果一致，脂多糖下調 EC間緊密連接相關蛋白的表達,如 ZO-1, occludin和ve-cadherin。并且我們運用3D基質凝膠細胞共培養(yǎng)模型，模擬正常體內生理環(huán)境，結合共聚焦顯微鏡，觀察病理條件下（脂多糖處理）PC和PVM/M對血管生成和穩(wěn)定性的影響，結果顯示脂多糖引起PC‘遷移’，激活

9、PVM/M引起形態(tài)學和性能改變，降低了PC和PVM/M對血管的生成和穩(wěn)定作用，引起血管網(wǎng)支架不穩(wěn)定，加速血管網(wǎng)支架降解。
　　本研究分為三個部分：
　　第一部分：小鼠血管紋血迷路屏障的細胞組成和在血迷路屏障中的分布
　　目的：
　　分析血管紋血迷路屏障的細胞組成和分布特點，原代培養(yǎng)血管紋 EC、PC和PVM/M并進行質粒轉染，建立穩(wěn)定表達質粒轉染的細胞株，建立3D細胞共培養(yǎng)模型，為下一步的功能研究提供基礎依據(jù)。<

10、br>　　方法：
　　分離血管紋，運用聚焦離子/電子雙束顯微電鏡(FIB/SEM)技術,獲取高清血管紋血迷路屏障超微結構圖，運用先進的VolRoverN軟件進行3D重建。離體，利用實驗室已經(jīng)建立的方法從小鼠耳蝸血管紋組織選擇性獲取血迷路屏障EC、PC和PVM/M進行原代培養(yǎng)，并分別用三種不同顏色的細胞熒光探針標記三種細胞系后建立3D懸滴球體共培養(yǎng)模型。進一步，用pE2-Crimson-N1質粒載體轉染EC、pmOrange2-N1

11、載體轉染PC、pEGFP-N2載體轉染PVM/M，篩選穩(wěn)定轉染的細胞，凍存?zhèn)溆茫⒗棉D染成功的細胞建立體外3D基質凝膠共培養(yǎng)模型，為更好研究血迷路屏障提供技術基礎。
　　結果：
　　1血管紋血迷路屏障的形態(tài)和構成
　　通過 FIB/SEM獲得高清血管紋超微結構圖,細胞邊緣可以自動分割出來， PVM/M、PC和EC之間的相互作用聯(lián)系被描出和量化，并運用先進的VolRoverN軟件進行3D重建，重建的結構圖清晰顯示三種細

12、胞的位置關系，有助于我們更好理解血迷路屏障結構。
　　23D懸滴球體共培養(yǎng)系統(tǒng)建立
　　利用實驗室已經(jīng)建立的方法，進行原代培養(yǎng)血管紋EC、PC和PVM/M，并分別用帶有不同顏色的熒光探針標記這三種細胞，建立3D懸滴球體共培養(yǎng)模型。
　　3成功建立分別表達 pE2-Crimson-N1、pmOrange2-N1、 pEGFP-N2質粒載體的三種細胞株，并利用轉染細胞建立3D基質凝膠共培養(yǎng)模型。
　　成功建立表達pE

13、2-Crimson-N1載體的血管紋EC株,表達pmOrange2-N1的血管紋PC株,表達pEGFP-N2載體的血管紋PVM/M株,利用轉染細胞建立3D基質凝膠共培養(yǎng)模型。
　　結論：
　　本文運用FIB/SEM獲得了血管紋血迷路屏障的高清超微結構圖，并運用先進的VolRoverN軟件進行3D重建，清晰的顯示三種細胞的位置關系，有助于我們更好理解血迷路屏障結構?？梢娧月菲琳铣擞苫|膜和EC構成外，該屏障周圍還有大量的周

14、細胞（pericyte,PC）和血管旁定居的巨噬細胞樣黑色素細胞（perivascular resident macrophage，PVM/Ms）。3D懸滴球體共培養(yǎng)模型能更好模擬細胞的體內環(huán)境，更有利于觀察血迷路屏障三種組成細胞之間的作用關系。成功建立穩(wěn)定表達pE2-Crimson-N1載體的血管紋EC株,表達pmOrange2-N1載體的血管紋PC株,表達pEGFP-N2載體的PVM/Ms株,利用轉染細胞成功建立了3D基質凝膠共培養(yǎng)

15、模型，為我們后續(xù)實驗奠定基礎。
　　第二部分：內毒素脂多糖對血迷路屏障影響的在體研究
　　目的：
　　通過體內實驗探討內毒素脂多糖對血迷路屏障的影響及具體作用機制。
　　方法：
　　通過鼓膜注射內毒素脂多糖建立中耳炎模型，結合冰凍切片，免疫熒光化學方法評估中耳炎模型的建立，通過活體‘血管-開窗’的方法結合熒光顯微鏡在體觀察內耳血迷路屏障對熒光物質 albumin-FITC滲透性的變化，分離血管紋，熒光定量分

16、析殘留熒光，比較對照組和 LPS處理組血管紋血迷路屏障的通透性變化。聽性腦干反應測聽評估 LPS處理后聽功能狀態(tài)的改變。石蠟切片結合共聚焦熒光顯微鏡觀察中耳炎模型內耳形態(tài)的變化。免疫組織化學的方法結合共聚焦熒光顯微鏡，觀察脂多糖對血管紋血迷路屏障PC和PVM/M的影響。通過熒光實時定量多聚酶鏈反應、蛋白質印跡、透射電鏡方法觀察脂多糖對血管紋緊密連接相關蛋白ZO-1, occludin,和VE-cadherin表達水平的影響。
　　

17、結果：
　　1脂多糖誘導中耳炎模型的評估
　　脂多糖導致鼓膜和中耳粘膜增厚水腫，中耳腔和鼓膜大量F4/80陽性炎性細胞浸潤。
　　2脂多糖可引起聽力損失
　　正常對照組在所有測試頻率均顯示出極好的聽力閾值。LPS處理組，在多個測試頻率都出現(xiàn)聽力閾值的明顯升高。
　　3內淋巴水腫
　　石蠟切片結果顯示，正常對照組耳蝸頂轉、中轉和底轉都未見內淋巴水腫， LPS處理組耳蝸頂轉和中轉見輕度內淋巴水腫，Reis

18、sner’s膜處可見褶皺。
　　4脂多糖對血迷路屏障通透性的影響
　　脂多糖導致血迷路屏障高通透性。正常對照組，活體熒光顯微鏡下未見血管網(wǎng)albumin-FITC滲出，LPS處理組血管網(wǎng)見多處albumin-FITC滲出。分離整個血管紋，LPS處理組albumin-FITC殘留比正常對照組顯著升高。
　　5脂多糖引起PC遷移和PVM/M的激活從而影響血管紋血迷路屏障完整性。
　　正常對照組，PC展示出扁平、細長的

19、形態(tài)且與EC緊密接觸；而在LPS處理組，PC呈明顯的圓形胞體，可見有細胞遷移脫離血管壁，并釋放大量顆粒。PVM/M在正常小鼠呈現(xiàn)細長樹枝狀，細胞膜表面無終端半乳糖基團的附著， GS-IB4陰性。然而48小時LPS處理后，細胞突起縮短，一些細胞變性，類似變形蟲樣形態(tài)，部分細胞被激活，與GS-IB4緊密結合，GS-IB4陽性。
　　6脂多糖對血管紋血迷路屏障緊密連接蛋白表達的影響。
　　mRNA水平，血管紋內 ZO-1、occl

20、udin和 VE-cadherin表達水平脂多糖處理48小時后較正常對照組明顯減低(n=3; P<0.01)，mRNA表達降低的同時，western blot結果顯示蛋白表達水平同樣也顯著降低(n=3;P<0.05)。
　　7透射電鏡下緊密連接形態(tài)學改變
　　透射電鏡下見正常對照組血管紋 EC之間廣泛、致密的緊密連接，而 LPS處理組緊密連接明顯減少。
　　結論：
　　1．脂多糖可引起聽力損傷。
　　2．脂

21、多糖導致內淋巴水腫。
　　3．脂多糖誘發(fā)的中耳炎癥下調緊密連接蛋白ZO-1，occludin，和VE-cadherin的表達，引起血迷路屏障組成細胞周細胞的遷移和血管旁定居的巨噬細胞樣黑色素細胞的激活，導致周細胞和血管旁定居的巨噬細胞樣黑色素細胞的形態(tài)和特性改變，破壞血迷路屏障的完整性，引起血管滲漏，破壞內耳平衡，參與血迷路屏障通透性增高的發(fā)病機制。
　　第三部分：內毒素脂多糖對血迷路屏障影響的離體研究
　　目的：

22、r>　　通過體外實驗探討內毒素脂多糖對血迷路屏障的影響及具體作用機制。
　　方法：
　　復蘇前述凍存的三類血迷路屏障來源的細胞，運用EC建立體外EC單層模型，離體觀察脂多糖作用下EC單層對熒光物質FITC-dextran通透性的變化。并利用細胞免疫熒光的方法結合共聚焦熒光顯微鏡觀察脂多糖對這三種細胞的影響，建立3D基質凝膠共培養(yǎng)模型，模擬正常體內生理環(huán)境，結合共聚焦顯微鏡，觀察病理條件下（脂多糖處理）PC和PVM/M對血管生

23、成和穩(wěn)定性的影響。利用原代培養(yǎng)的EC建立體外EC單層模型，結合免疫細胞化學、蛋白質印跡和熒光實時定量多聚酶鏈反應等方法觀察脂多糖對緊密連接蛋白 ZO-1, occludin,和VE-cadherin表達水平的影響。
　　結果：
　　1脂多糖對血管紋EC單細胞層通透性的影響
　　利用實驗室已經(jīng)建立的方法培養(yǎng)EC并建立EC單細胞層模型，LPS處理結果顯示，處理2h即開始出現(xiàn) FITC-dextran滲透率增高，隨著時間延長

24、， FITC-dextran滲透率逐漸增高。
　　2脂多糖導致PC和血管旁定居的巨噬細胞樣黑色素細胞形態(tài)學改變。
　　正常PC呈個大、扁平具有寬偽足的星形形態(tài)，而經(jīng)LPS處理后PC分支增多，并釋放大量的顆粒。與在體結果相一致，LPS處理后血管旁定居的巨噬細胞樣黑色素細胞細胞突起變短，部分細胞被激活， GS-IB4陽性.
　　3脂多糖降低了 PC和血管旁定居的巨噬細胞樣黑色素細胞對血管的生成和穩(wěn)定作用。
　　正常組

25、PC與EC形成的‘血管網(wǎng)’緊密相貼，未見細胞遷移，LPS處理組，見PC脫離‘血管支架’，發(fā)生遷移。正常組，PVM/M，從胞體發(fā)出細長的突起，緊緊包繞EC形成的‘血管網(wǎng)’，血管支架穩(wěn)定，LPS組，突起縮短，胞體變小，支架不穩(wěn)定，‘血管網(wǎng)’支架破壞。
　　4脂多糖對EC單層緊密連接蛋白表達的影響。
　　在mRNA水平，occludin和 VE-cadherin在LPS2h組、8h組和24h組較正常對照組均明顯降低，zo-1mRN

26、A表達水平在LPS8h和LPS24h組明顯降低。mRNA表達水平降低的同時，in cell western結果顯示三者在LPS24h組蛋白水平的表達同樣有顯著降低。此外,共聚焦顯微鏡拍攝的免疫組化照片清楚的顯示LPS處理下 EC單細胞層模型細胞之間的緊密連接相關蛋白密度明顯降低，EC之間的間隙變大。
　　結論：
　　1脂多糖可引起 PC‘遷移’，激活血管旁定居的巨噬細胞樣黑色素細胞,引起細胞形態(tài)和性能改變，降低了PC和PVM