電磁脈沖對(duì)血—視網(wǎng)膜屏障通透性的影響及分子機(jī)制的研究.pdf

1、電磁脈沖（electromagneticpulse，EMP）作為脈沖式電磁輻射，與連續(xù)波相比具有更明顯的生物學(xué)效應(yīng)，其對(duì)機(jī)體健康的影響日益引起關(guān)注。眼是EMP照射的敏感效應(yīng)器官，血-視網(wǎng)膜屏障（blood-retinalbarrier，BRB）的限制性通透性維持視網(wǎng)膜內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，從而保證視網(wǎng)膜功能的正常發(fā)揮。前期實(shí)驗(yàn)表明，一定參數(shù)的EMP照射引起B(yǎng)RB通透性增加，但該效應(yīng)的時(shí)效規(guī)律及分子機(jī)制尚不清楚。本研究旨在確立一定參數(shù)的EMP照射

2、引起B(yǎng)RB通透性增加的時(shí)效規(guī)律，研究緊密連接蛋白作為BRB重要的結(jié)構(gòu)和功能單位在該生物效應(yīng)中的變化，并從絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activatedproteinkinase，MAPK）信號(hào)通路切入，初步探討該生物效應(yīng)中可能的分子機(jī)制。
　　在體實(shí)驗(yàn)，以成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠為研究對(duì)象，以伊文思藍(lán)（EvansBlue，EB）染料及內(nèi)源性白蛋白為示蹤劑，采用視網(wǎng)膜鋪片法、EB定量檢測(cè)法及白蛋白免疫

3、印跡雜交法（WesternBlot）檢測(cè)EMP（200kV/m，200次）照射后大鼠BRB通透性的變化。視網(wǎng)膜鋪片顯示：假輻照組血管走行清楚，無(wú)EB滲漏；EMP照射后0.5小時(shí)（h），視網(wǎng)膜局部血管出現(xiàn)EB滲漏，血管結(jié)構(gòu)尚清楚；照射后3h、6h多視野EB滲漏，滲漏程度及數(shù)目均較0.5h組增加，滲漏區(qū)血管結(jié)構(gòu)不清；照射后12hEB滲漏量開始逐漸減少，血管結(jié)構(gòu)漸清楚。EB定量檢測(cè)顯示：與假輻照組相比，EMP照射后0.5h，滲漏的EB染料含量

4、增高；照射后3h、6h，EB滲漏值達(dá)高峰；照射后12h，EB滲漏值開始降低；照射后48h，EB滲漏量與假輻照組比較無(wú)差異。白蛋白WesternBlot結(jié)果顯示：與假輻照組相比，白蛋白滲漏量于照射后0.5h開始上升，3h、6h達(dá)高峰，12h開始下降。明確EMP致BRB開放的時(shí)效規(guī)律后，采用WesternBlot法檢測(cè)緊密連接蛋白ZO-1、occludin及claudin-5，結(jié)果顯示：照射后各時(shí)間點(diǎn)ZO-1表達(dá)量與假輻照組比較均無(wú)差異。與

5、假輻照組比較，照射后3h、6h組occludin表達(dá)量下調(diào)；照射后0.5h、3h、6h、12h組claudin-5表達(dá)量下調(diào)。采用WesternBlot法檢測(cè)MAPK信號(hào)通路的相關(guān)信號(hào)分子：p38、p-p38、JNK、p-JNK、ERK及p-ERK。檢測(cè)結(jié)果顯示：與假輻照組比較，EMP照射后各時(shí)間點(diǎn)p38、JNK、ERK表達(dá)量均無(wú)變化，照射后0.5h，p-p38、p-JNK、p-ERK表達(dá)量均上調(diào)。
　　離體實(shí)驗(yàn)部分以RF/6A（

6、恒河猴視網(wǎng)膜/脈絡(luò)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞）為研究對(duì)象。采用transwell小室共培養(yǎng)RF/6A與C6（大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞）建立血視網(wǎng)膜內(nèi)屏障（innerBRB）的體外模型，并檢測(cè)EMP（200kV/m，200次）照射對(duì)該屏障通透性的影響。通透性的檢測(cè)指標(biāo)為跨內(nèi)皮電阻抗（transendothelialelectricalresistance，TEER）及辣根過氧化物酶（horseradishperoxidase，HRP）透過率。結(jié)果顯示：EMP照

7、射后0.5h、3h、6h，TEER值較假輻照組降低，HRP透過率較假輻照組增高。二者結(jié)果表明EMP照射后，BRB內(nèi)屏障體外模型通透性呈現(xiàn)先增高后恢復(fù)的趨勢(shì)。采用WesternBlot法檢測(cè)RF/6A細(xì)胞緊密連接蛋白o(hù)ccludin、claudin-5及ZO-1的表達(dá)量，結(jié)果顯示：與假輻照組比較，EMP照射后0.5h、3h、6h，occludin及claudin-5蛋白表達(dá)量下調(diào)；EMP照射后各時(shí)間點(diǎn)，ZO-1表達(dá)量與假輻照組比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)

8、學(xué)差異。采用WesternBlot法檢測(cè)MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白p-p38、p-HSP27、p-JNK以及p-ERK等。檢測(cè)結(jié)果顯示：EMP照射后0.5h，與假輻照組比較p-p38、p-HSP27、p-JNK以及p-ERK表達(dá)量上調(diào)。為進(jìn)一步研究EMP照射引起B(yǎng)RB開放的分子機(jī)制，以特異性抑制劑SB203580、SP600125及U0126分別選擇性p38-MAPK、JNK及MEK1/2，阻滯p38、JNK及ERK1/2信號(hào)分子的磷酸化

9、，并以WesternBlot法檢測(cè)RF/6A緊密連接蛋白o(hù)ccludin及claudin-5表達(dá)量。檢測(cè)結(jié)果顯示：使用p38抑制劑SB203580預(yù)處理組，EMP照射所致occludin及claudin-5蛋白表達(dá)下調(diào)被阻滯；另兩組抑制劑預(yù)處理組未能阻滯EMP照射所致occludin及claudin-5蛋白表達(dá)量下調(diào)。由此證明，p38-MAPK信號(hào)通路參與誘導(dǎo)EMP照射所致BRB通透性增加的生物學(xué)效應(yīng)。
　　本研究結(jié)果表明，EMP