缺氧后處理、藥物后處理激活Nrf2-ARE通路機(jī)制的研究.pdf

1、目的:建立成年SD大鼠心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷模型,觀察缺氧/乳化異氟醚(EI)/吡那地爾(P)后處理對(duì)大鼠心肌細(xì)胞的影響,目的:1.以核相關(guān)因子2(Nrf2)為靶點(diǎn),探討Nrf2-抗氧化反應(yīng)元件(ARE)通路在缺氧/藥物后處理心肌保護(hù)機(jī)制中的作用,應(yīng)用活性氧清除劑N-(2-巰基丙酰基)-甘氨酸(MPG)處理,與不加MPG的組對(duì)比觀察Nrf2-ARE通路下游產(chǎn)物HO-1、Nqo-1、SOD-1的mRNA及蛋白表達(dá)量的變化,以明確活性氧(RO

2、S)在上述后處理方式心肌保護(hù)中的作用,即Nrf2-ARE通路激活的可能機(jī)制;2.通過對(duì)ROS濃度的測(cè)定,觀察缺血后處理、兩種藥物后處理不同濃度以及脂肪乳對(duì)照組對(duì)ROS水平的影響,證明上述后處理方式誘發(fā)的ROS水平是否與心肌保護(hù)效果有關(guān)。
　　方法:
　　1.通過Langendorff灌注離體心臟,分離、培養(yǎng)成年大鼠心肌細(xì)胞,建立心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷模型, Nrf2-ARE通路激活機(jī)制的研究將心肌細(xì)胞隨機(jī)分為9個(gè)組,正常組(N

3、組)、對(duì)照組(H/R組)、缺氧后處理組(HPO組)、乳化異氟醚(1.68mmol/L組)后處理組(EI2)、脂肪乳組(FAT)、吡那地爾(50μmol/L)后處理組(P50)及缺氧后處理和MPG處理組(HPO+MPG)、乳化異氟醚和MPG處理組(EI+MPG)、吡那地爾和MPG處理組(P+MPG)。分離后的心肌細(xì)胞培養(yǎng)20h,除N組持續(xù)培養(yǎng)110min,其余各組均缺氧45 min,H/R組復(fù)氧60min;HPO組缺氧45 min后缺氧、

4、復(fù)氧重復(fù)3次,每次各5 min,再繼續(xù)復(fù)氧60 min;EI2組缺氧45 min后以1.68 mmol/LEI處理5 min,復(fù)氧60 min;FAT組缺氧45 min后以脂肪乳處理5 min,復(fù)氧60 min;P50組缺氧45 min后以50μmol/L P處理5 min,復(fù)氧60 min;HPO+MPG組缺氧、復(fù)氧重復(fù)后MPG處理10min,復(fù)氧60min;EI+MPG組用EI處理5 min、MPG處理10min,復(fù)氧60min;P

5、+MPG組用P處理5 min、MPG處理10min,復(fù)氧60min。
　　2.熒光共聚焦顯微鏡下觀察復(fù)氧末心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平及Nrf2核轉(zhuǎn)位。
　　3.透射電子顯微鏡觀察缺氧復(fù)氧損傷后的心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)并對(duì)其進(jìn)行線粒體評(píng)分。
　　4. Real-Time PCR及Western blot技術(shù)檢測(cè)復(fù)氧末心肌細(xì)胞中Nrf2、HO-1、SOD1、和NQO1的基因mRNA表達(dá)及蛋白質(zhì)表達(dá)情況。
　　5. ROS濃度與后

6、處理激活通路程度的相關(guān)性研究,用酶聯(lián)免疫吸附劑 ELISA法測(cè)定不加MPG的各組心肌細(xì)胞及乳化異氟醚不同濃度后處理組(0.84、1.68和2.52mmol/L,EI1,EI2,EI3組)和吡那地爾不同濃度后處理組(25、50和100μmol/L, P25,P50,P100組)心肌細(xì)胞的復(fù)氧5min和60min活性氧含量,并用復(fù)氧60min時(shí)ROS含量與Nrf2 mRNA和蛋白的表達(dá)量作比較。
　　結(jié)果:
　　1.熒光共聚焦顯

7、微鏡檢測(cè)心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子:與N組比較,其它各組熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)(P<0.05);與H/R組比較,其它各組熒光強(qiáng)度明顯減弱(P<0.05),其中HPO組熒光強(qiáng)度明顯低于H/R組和FAT組(P<0.05),HPO、EI2和P50組熒光強(qiáng)度相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),而HPO、EI2和P50組熒光強(qiáng)度低于加用活性氧清除劑MPG處理組(P<0.05)。
　　2.熒光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)Nrf2的亞細(xì)胞分布:N組心肌細(xì)胞核內(nèi)N

8、rf2蛋白熒光強(qiáng)度低;H/R組與N組比較心肌細(xì)胞核內(nèi)Nrf2蛋白熒光強(qiáng)度增強(qiáng)(P<0.05);與H/R組比較,其它各組熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)(P<0.05),其中HPO組、EI2組及P50組心肌細(xì)胞核內(nèi)Nrf2蛋白熒光強(qiáng)度相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),但是均強(qiáng)于FAT組(P<0.05);而HPO、EI2和P50組熒光強(qiáng)度高于加用活性氧清除劑MPG處理組(P<0.05)。
　　3.電鏡結(jié)果顯示N組心肌細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)正常;H/R組

9、心肌線粒體損傷最嚴(yán)重;HPO組、EI2組與P50組心肌線粒體損傷較輕,且損傷程度明顯低于FAT組(P<0.05);FAT組心肌線粒體損傷程度輕于H/R組(P<0.05);而HPO、EI2和P50組心肌線粒體損傷程度輕于加用活性氧清除劑MPG處理組(P<0.05)。
　　4. Nrf2、HO-1、SOD1、和NQO1 mRNA表達(dá)量:與N組相比,其它各組的Nrf2、HO-1、SOD1及NQO1基因mRNA表達(dá)量明顯降低(P<0.05

10、);與H/R組相比,其它各組基因mRNA表達(dá)量顯著增高(P<0.05);其中HPO、EI2和P50組基因mRNA表達(dá)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),但三組各基因mRNA顯著高于FAT組(P<0.05);HPO、EI2和P50組基因mRNA表達(dá)量均分別高于加用活性氧清除劑MPG處理組(P<0.05)。
　　5. Nrf2、HO-1、SOD1、和NQO1蛋白質(zhì)表達(dá)量:與N組相比,各組Nrf2、HO-1、NQO1和SOD1蛋白質(zhì)表達(dá)量顯

11、著降低(P<0.05);與H/R組相比,其余各組蛋白質(zhì)表達(dá)量增高(P<0.05);其中HPO、EI2和P50組蛋白質(zhì)表達(dá)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),但三組蛋白表達(dá)量均高于FAT組(P<0.05); FAT組蛋白質(zhì)表達(dá)量略高于H/R組(P<0.05);而HPO、EI2和P50組各蛋白表達(dá)量均分別高于加用活性氧清除劑MPG處理組(P<0.05)。
　　6.活性氧含量:在復(fù)氧5min、60min時(shí),與N組相比,各組ROS含量均顯著增

12、高(P<0.05);與H/R組相比,其余各組ROS含量降低(P<0.05);其中HPO、EI2和P50組ROS含量無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),但其ROS含量均低于FAT組(P<0.05);FAT組ROS含量略低于H/R組,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。EI1、EI2和EI3組ROS含量在復(fù)氧5min時(shí)隨濃度升高而增加(P<0.05);EI1和EI3組ROS含量復(fù)氧60min時(shí)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),均明顯高于EI2組(P<

13、0.05);組內(nèi)比較,與復(fù)氧5min相比,EI三個(gè)不同濃度組復(fù)氧60min時(shí)ROS含量均顯著降低(P<0.05);P25、P50和P100組ROS含量在復(fù)氧5min時(shí)隨濃度升高而增加(P<0.05);P25和P100組ROS含量復(fù)氧60min時(shí)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),均明顯高于P50組(P<0.05);組內(nèi)比較,與復(fù)氧5min相比,P三個(gè)不同濃度組復(fù)氧60min時(shí)ROS含量均顯著降低(P<0.05)。不同濃度乳化異氟醚后處理/

14、吡那地爾后處理缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞后,在復(fù)氧后60min測(cè)得的ROS含量與Nrf2 mRNA和蛋白的表達(dá)量均呈負(fù)線性相關(guān)(P<0.01)。
　　結(jié)論:
　　1.缺氧后處理/EI后處理/P后處理通過在再灌注時(shí)產(chǎn)生的ROS激活Nrf2-ARE通路,上調(diào)其下游的抗氧化蛋白和Ⅱ相解毒酶的表達(dá),從而起到抗心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷的作用。
　　2.不同濃度的兩種藥物(吡那地爾和乳化異氟醚)后處理,通過在再灌注早期產(chǎn)生不同水平的ROS,激活