Nrf2-ARE通路在大鼠心肌細(xì)胞缺氧-乳化異氟醚后處理中作用的研究.pdf

1、目的:建立成年SD大鼠心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷模型，觀察缺氧/乳化異氟醚(EI)后處理對(duì)大鼠心肌細(xì)胞的影響，以Nrs2為靶點(diǎn)，探討核因子相關(guān)因子2(Nrf2)-抗氧化反應(yīng)元件（ARE）通路在缺氧/EI后處理心肌保護(hù)中的機(jī)制，以及藥物后處理替代缺氧后處理的可能性。
　　 方法:
　　 1.通過(guò)Langendorff灌注離體心臟，分離、培養(yǎng)成年大鼠心肌細(xì)胞，建立心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷模型，將心肌細(xì)胞隨機(jī)分為7個(gè)組，正常組（N組）、

2、對(duì)照組(C組）、缺氧后處理組（IPO組）、EI不同濃度后處理組(0.84、1.68、2.52) mmol/L，EI1，EI2，EI3組)和脂肪乳處理組（FAT組）。分離后的心肌細(xì)胞培養(yǎng)20h，除N組持續(xù)培養(yǎng)110 min，其余各組均缺氧45 min復(fù)氧60min。IPO組缺氧45 min后缺氧、復(fù)氧重復(fù)3次，每次各5 min，在繼續(xù)復(fù)氧60min;EI1、EI2和EI3組缺氧45 min后分別以(0.84、1.68、2.52) mmol

3、/L EI處理5 min，復(fù)氧60 min; FAT組缺氧45 min后分別以脂肪乳處理5 min，復(fù)氧60 min。
　　 2.透射電子顯微鏡觀察缺氧復(fù)氧損傷后的心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)并對(duì)其進(jìn)行線粒體評(píng)分。
　　 3.Real-Time PCR及Western blot技術(shù)檢測(cè)復(fù)氧末心肌細(xì)胞中Nrf2、HO-1、SOD1、和NQO1的基因mRNA表達(dá)及蛋白質(zhì)表達(dá)情況。
　　 4.熒光共聚焦顯微鏡下觀察復(fù)氧末心肌細(xì)胞內(nèi)

4、鈣離子水平及Nrf2核轉(zhuǎn)位。
　　 結(jié)果:
　　 1.電鏡結(jié)果顯示N組心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)正常，C組超微結(jié)構(gòu)損傷嚴(yán)重，IPO組、不同濃度EI組、均優(yōu)于FAT組和C組，但I(xiàn)PO組、EI2組優(yōu)于EI1組和EI3組，F(xiàn)AT組稍優(yōu)于C組;線粒體評(píng)分結(jié)果與心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)結(jié)果變化趨勢(shì)一致。
　　 2.Nrf2、HO-1、SOD1、和NQO1 mRNA表達(dá)量:與N組相比，其它各組Nrf2、HO-1、SOD1、和NQO1基因mRN

5、A表達(dá)量明顯降低(P＜0.05);與C組相比，其它各組基因mRNA表達(dá)量顯著增高（P＜0.05）;其中IPO和EI2組基因mRNA表達(dá)量顯著高于EI1和EI3組(P＜0.05);EI1和EI3組Nrf2、HO-1、SOD1、和NQO1的基因mRNA表達(dá)無(wú)顯著差異(P＞0.05），F(xiàn)AT組mRNA表達(dá)量高于C組（P＜0.05）。
　　 3.Nrf2、HO-1、SOD1、和NQO1蛋白質(zhì)表達(dá)量:與N組相比，其余各組Nrf2、HO-1

6、、SOD1、和NQO1蛋白表達(dá)量明顯降低(P＜0.05);與C組相比，其余各組蛋白表達(dá)量增高（P＜0.05）;其中IPO和EI2組Nrf2、HO-1、SOD1、和NQO1蛋白質(zhì)表達(dá)量顯著高于EI1和EI3組（P＜0.05）;IPO與EI2組蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異(P＞0.05);FAT組蛋白表達(dá)量高于C組（P＜0.05）。
　　 4.熒光共聚焦顯微鏡檢測(cè)心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子:與N組比較，其它他各組熒光強(qiáng)度增強(qiáng)（P＜0.05）;與C組比較

7、，其它各組熒光強(qiáng)度明顯減弱（P＜0.05），其中IPO和EI2組熒光強(qiáng)度明顯低于EI1和EI3組（P＜0.05），IPO與EI2兩組比較差異不顯著(P＞0.05)，F(xiàn)AT組熒光強(qiáng)度低于C組(P＜0.05)。
　　 5.熒光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)Nrf2的亞細(xì)胞分布。在不同的實(shí)驗(yàn)組有明顯改變，N組心肌細(xì)胞核內(nèi)Nrf2蛋白熒光強(qiáng)度低;C組與N組比較心肌細(xì)胞核內(nèi)Nrf2蛋白熒光強(qiáng)度增強(qiáng)（P＜0.05）;與C組比較，IPO組及EI組心肌

8、細(xì)胞核內(nèi)Nrf2蛋白熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)(P＜0.05);其中IPO組和EI2組核內(nèi)Nrf2蛋白熒光強(qiáng)度明顯高于EI1和EI3組(P＜0.05)，IPO與EI2組比較，核內(nèi)Nrf2蛋白熒光強(qiáng)度差異不顯著(P＞0.05)，F(xiàn)AT組細(xì)胞核內(nèi)Nrf2蛋白熒光強(qiáng)度高于C組(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.缺氧復(fù)氧對(duì)原代培養(yǎng)的成年大鼠心肌細(xì)胞可以造成明顯損傷，缺氧、EI、脂肪乳后處理均能改善缺氧心肌細(xì)胞功能，與脂肪乳相比，缺

9、血、乳化異氟醚后處理具有更確切的心肌保護(hù)作用
　　 2.缺氧、不同濃度EI后處理均可激活Nrf2及其下游抗氧化蛋白和II相解毒酶基因mRNA的表達(dá)，從而發(fā)揮心肌保護(hù)效應(yīng)，而在本實(shí)驗(yàn)所用濃度范圍中EI2(1.68mmol/L)效果最佳。
　　 3.缺氧、不同濃度EI后處理均能減少心肌細(xì)胞內(nèi)鈣超載，起到保護(hù)缺氧心肌細(xì)胞的作用。
　　 4.缺氧、不同濃度EI后處理均可誘導(dǎo)Nrf2核轉(zhuǎn)位，從而發(fā)揮心肌保護(hù)效應(yīng)，激活Nrf