鼓室內(nèi)慶大霉素注射在外周前庭分布和損傷的研究.pdf

1、第一部分:鼓室內(nèi)慶大霉素注射在外周前庭的時間和空間分布研究
　　一、GTTR鼓室內(nèi)注射后在外周前庭的時間和空間分布
　　目的:應(yīng)用慶大霉素德克薩斯紅耦合物(gentamicin-conjugated Texas Red，即GTTR)鼓室內(nèi)注射后觀察其在外周前庭的時間和空間分布特點(diǎn)。
　　方法:成年豚鼠行鼓室內(nèi)GTTR(0.1 mg/ml，50ul)注射一次，在注射后12h、24h、3d、7d、14d、28d處死動物，a

2、nti-Calretinin標(biāo)記前庭Ⅰ型毛細(xì)胞，DAPI染核，運(yùn)用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察GTTR在外周前庭的聚集和分布情況。并進(jìn)行熒光密度半定量分析。
　　結(jié)果:鼓室內(nèi)GTTR一次性注射后在12小時即可見在外周前庭終末器官的Ⅰ型及Ⅱ型毛細(xì)胞、移行細(xì)胞、半月面細(xì)胞有明顯聚集，在毛細(xì)胞中GTTR熒光顆粒主要聚集于表皮板及其下方，胞漿內(nèi)可見極少量的彌散性分布;移行細(xì)胞和半月面細(xì)胞中的GTTR主要分布于核上區(qū);暗細(xì)胞、支持細(xì)胞、半規(guī)管上

3、皮細(xì)胞未見明顯GTTR顆粒聚集。GTTR熒光顆粒在外周前庭感覺上皮3-7天聚集達(dá)到最高峰，并持續(xù)到28天熒光強(qiáng)度有明顯的下降(P＜0.05);在移行細(xì)胞和半月面細(xì)胞至第28天仍可見明顯聚集。GTTR在球囊斑的聚集分布較橢圓囊斑多，且有顯著性統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，GTTR在后半規(guī)管的分布聚集較其他兩個半規(guī)管為多，但統(tǒng)計學(xué)無顯著性差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論:慶大霉素可聚集分布于外周前庭的感覺上皮中，其分布高峰位于3-7天，

4、在28天有明顯下降。慶大霉素在球囊斑的分布較橢圓囊斑為多。慶大霉素可以聚集分布在移行細(xì)胞、半月面細(xì)胞中。慶大霉素在暗細(xì)胞沒有明顯分布。
　　二、不同濃度GTTR鼓室內(nèi)注射在外周前庭的分布
　　目的:觀察不同濃度的GTTR鼓室內(nèi)一次性注射在半規(guī)管壺腹嵴的分布情況，從而了解不同類型的毛細(xì)胞對慶大霉素的吸收聚集特點(diǎn)。
　　方法:將不同濃度的GTTR(0.1，0.4，0.8mg/ml)行鼓室內(nèi)慶大霉素注射后在慶大霉素時間分布的

5、高峰第七天處死動物，anti-Calretinin標(biāo)記前庭中央?yún)^(qū)Ⅰ型毛細(xì)胞，DAPI標(biāo)記細(xì)胞核，激光共聚焦掃描顯微鏡進(jìn)行，觀察不同類型的細(xì)胞的吸收聚集情況，并進(jìn)行熒光半定量分析。
　　結(jié)果:0.1 mg/mlGTTR濃度組可見慶大霉素主要分布于毛細(xì)胞的表皮板及其下方，胞漿內(nèi)可見非常微弱的熒光分布，隨著濃度的增加至0.4mg/ml，GTTR在中央?yún)^(qū)Ⅰ型毛細(xì)胞的分布由主要聚集于表皮板下到開始出現(xiàn)較多胞漿彌散性分布，至0.8mg/ml周

6、邊區(qū)Ⅰ型毛細(xì)胞也開始出現(xiàn)較彌散性分布，GTTR在Ⅱ型毛細(xì)胞中始終聚集于頂端未出現(xiàn)胞漿明顯彌散性分布，統(tǒng)計學(xué)顯示GTTR在三種類型的毛細(xì)胞中的分布有明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。GTTR在移行細(xì)胞和半月面細(xì)胞低濃度時即有分布，但并未隨著濃度的增加有明顯增加，也未出現(xiàn)胞漿彌散性分布。
　　結(jié)論:慶大霉素在半規(guī)管感覺上皮毛細(xì)胞的分布具有從中央?yún)^(qū)Ⅰ型毛細(xì)胞到外周區(qū)Ⅰ型毛細(xì)胞，再到Ⅱ型毛細(xì)胞的濃度梯度分布特點(diǎn)。慶大霉素在移行細(xì)胞和半月面核

7、上區(qū)有明顯聚集，但并未隨濃度增加出現(xiàn)胞漿彌散性分布。
　　三、小劑量慶大霉素鼓室內(nèi)注射在外周前庭的分布
　　目的:觀察小劑量的慶大霉素鼓室內(nèi)一次性注射在外周前庭的分布情況，從而了解慶大霉素在前庭聚集分布特點(diǎn)，并與GTTR在外周前庭的分布進(jìn)行對比。
　　方法:將慶大霉素(5 mg/ml)行鼓室內(nèi)一次性注射第7天處死動物，Anti-Gentamicin染色，DAPI標(biāo)記細(xì)胞核，激光共聚焦掃描顯微鏡進(jìn)行，觀察慶大霉素抗體染色

8、在壺腹嵴和囊斑的熒光分布，并進(jìn)行熒光半定量分析。
　　結(jié)果:慶大霉素在感覺上皮細(xì)胞中可呈濃度梯度分布，首先分布中央型Ⅰ型毛細(xì)胞，其次為周邊型Ⅰ型毛細(xì)胞，最后為Ⅱ型毛細(xì)胞。熒光半定量分析各類型細(xì)胞之間的分布有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，這一分布特點(diǎn)與GTTR相類似。慶大霉素在移行細(xì)胞、半月面細(xì)胞未見明顯聚集分布，這一現(xiàn)象與GTTR研究結(jié)果不相同。
　　結(jié)論:慶大霉素在壺腹嵴毛細(xì)胞的分布具有從中央?yún)^(qū)Ⅰ型毛細(xì)胞到外周區(qū)Ⅰ型毛細(xì)胞，

9、再到Ⅱ型毛細(xì)胞的梯度分布特點(diǎn)。與慶大霉素抗體相比，GTTR有更高的靈敏度。
　　第二部分慶大霉素對外周前庭損傷性研究
　　目的:探討慶大霉素對外周前庭壺腹嵴和囊斑的損傷情況及其分布之間的關(guān)系。
　　方法:不同濃度慶大霉素(15，30mg/ml)行豚鼠鼓室內(nèi)注射后，在第7天和28天分別處死動物，三個半規(guī)壺腹嵴行冰凍切片后用anti-Calretinin標(biāo)記前庭中央?yún)^(qū)Ⅰ型毛細(xì)胞，anti-tencisin標(biāo)記所有Ⅰ型毛細(xì)胞

10、，DAPI標(biāo)記細(xì)胞核。兩個囊斑，用phalloidin-TRIRC標(biāo)記纖毛。熒光顯微鏡及激光共聚焦掃描顯微鏡掃描拍片，Image-pro-plus圖像處理，SPSS進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　結(jié)果:慶大霉素濃度15mg/ml7天組動物可見半規(guī)管中央?yún)^(qū)Ⅰ型毛細(xì)胞的神經(jīng)盞有部分回縮或者完全回縮到支持細(xì)胞層，細(xì)胞核密度較正常對照組無明顯差異。周邊型Ⅰ型毛細(xì)胞無明顯改變，慶大霉素濃度15mg/ml28天組及30mg/ml7天組可見Ⅰ型毛細(xì)胞的神

11、經(jīng)盞均回縮到基膜層;周邊型Ⅰ型毛細(xì)胞無明顯改變或者部分減少，中央?yún)^(qū)細(xì)胞核密度較正常減少;慶大霉素30mg/ml28天組可見中央型Ⅰ型細(xì)胞均回縮到基膜層，周邊型Ⅰ型毛細(xì)胞明顯減少，中央?yún)^(qū)和周邊區(qū)細(xì)胞核均較正常減少形成單層感覺上皮細(xì)胞。慶大霉素注射后7天組動物，可見微紋區(qū)纖毛首先受損，球囊斑殘余毛細(xì)胞較橢圓囊斑多。28天組可見球囊斑纖毛較橢圓囊斑多，球囊斑較橢圓囊斑多。
　　結(jié)論:慶大霉素在壺腹嵴感覺上皮的損傷同分布相一致，呈現(xiàn)從中央

12、Ⅰ型到周邊Ⅰ型最后到Ⅱ型的梯度損傷特點(diǎn)。慶大霉素在囊斑的損傷同分布呈負(fù)相關(guān)，橢圓囊對慶大霉素?fù)p傷較球囊更為敏感。
　　第三部分、豚鼠外周前庭器官體外培養(yǎng)GTTR的分布特點(diǎn)
　　目的:觀察成年豚鼠外周前庭器官體外懸浮培養(yǎng)時，GTTR在外周前庭器官的聚集分布特點(diǎn)，并與在體分布進(jìn)行比較。
　　方法:成年豚鼠橢圓囊斑和半規(guī)管分離，去除耳石和剪開壺腹嵴相對應(yīng)的膜性組織后進(jìn)行體外培養(yǎng)。培養(yǎng)液中加有GTTR(0.00125mg/ml

13、)，在培養(yǎng)后30min、2h進(jìn)行觀察，冰凍切片后anti-calretinin，Phalloidin，DAPI染色后運(yùn)用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察GTTR聚集和分布情況。
　　結(jié)果:成年豚鼠橢圓囊斑體外培養(yǎng)在30分鐘、2小時均有較好的形態(tài)，纖毛生長良好;半規(guī)管30分鐘，2小時壺腹嵴感覺上皮細(xì)胞核排列整齊。體外培養(yǎng)狀態(tài)下GTTR在壺腹嵴感覺上皮細(xì)胞中分布同在體分布，首先分布于中央?yún)^(qū)Ⅰ型毛細(xì)胞，其次為周邊區(qū)Ⅰ型毛細(xì)胞，最后為Ⅱ型毛細(xì)胞。