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文檔簡介
1、背景和目的:
慢性病毒性肝炎是一種嚴(yán)重危害人類健康的常見病、多發(fā)病,疾病后期可發(fā)展為肝硬化、肝癌,嚴(yán)重危害人類健康。近來肝臟影像學(xué)及病理檢查發(fā)現(xiàn),部分慢性病毒性肝炎患者伴有脂肪變性,甚至高達(dá)50-72%的HCV感染者出現(xiàn)脂肪肝。肝脂肪變性對于慢性病毒性肝炎患者肝纖維化進(jìn)展和抗病毒療效均產(chǎn)生重要影響。動物模型已經(jīng)為人類研究疾病做出了巨大貢獻(xiàn),建立各種疾病動物模型,現(xiàn)已被視為研究發(fā)病機(jī)制以及探討相應(yīng)治療方法的重要手段。但目前尚
2、缺乏理想的實驗動物模型來闡明慢性病毒性肝炎誘發(fā)肝脂肪變性的具體的發(fā)病機(jī)制,從而使得對其防治的研究受到很大的局限。目前已建立的慢性病毒性肝炎實驗動物模型存在體內(nèi)缺乏病原體復(fù)制、與臨床情況顯著不同等局限性,目前尚未見慢性病毒性肝炎繼發(fā)肝脂肪變性的動物模型的報道。
小鼠肝炎病毒(mouse hepatitis virus,MHV)最早于1949年被發(fā)現(xiàn),屬于冠狀病毒,是一類RNA病毒,可以導(dǎo)致肝臟和中樞系統(tǒng)的疾病和廣泛的免疫功能
3、障礙。其中,MHV-A59型病毒由于其不易感染人,同時具有嗜肝性與嗜神經(jīng)組織性,一般用來復(fù)制神經(jīng)脫髓鞘疾病與爆發(fā)型肝炎模型,由于國內(nèi)對MHV-A59在細(xì)胞模型的建立及小鼠感染品種與劑量有了一定的研究基礎(chǔ),本課題所采用小鼠肝炎病毒MHV-A59作為生物致病因子,建立小鼠慢性病毒性肝炎誘發(fā)肝脂肪變性的動物模型,為進(jìn)一步在體內(nèi)研究慢性病毒性肝炎誘發(fā)肝脂肪變性的相關(guān)機(jī)制提供適宜的動物模型和理論基礎(chǔ)。
方法:
選用6-
4、7周齡的SPF級C57BL/6小鼠。制備MHV-A59病毒液,將制備的MHV-A59病毒液按10-3、10-4、10-5、10-6、10-7濃度稀釋。C57BL/6小鼠30只隨機(jī)分為5個濃度組(每組6只小鼠)。5種濃度病毒液分別感染5組小鼠,每只小鼠腹腔注射0.5ml。連續(xù)觀察2周,記錄生存小鼠,按照Reed-Muench法計算病毒半致死劑量(LD50),確定實驗中所需病毒的適宜劑量。隨后取C57BL/6小鼠120只隨機(jī)分為4組:①對照
5、組(以普通飼料喂養(yǎng));②高脂組(以高脂飼料喂養(yǎng));③病毒組(感染MHV-A59,以普通飼料喂養(yǎng));④高脂病毒組(感染MHV-A59,以高脂飼料喂養(yǎng)),高脂飼料配方為:87.6%普通飼料十2%膽固醇+10%豬油+0.4%膽酸鈉。分別于造模第1天和第30天按10-6病毒濃度0.5ml腹腔注射MHV-A59病毒,每周動態(tài)監(jiān)測小鼠一般狀況和體質(zhì)量,于造模后第13周末處死小鼠,取血清檢測MHV抗體(ELISA法)、血清脂質(zhì)和轉(zhuǎn)氨酶(濕化學(xué)法);小
6、鼠肝臟冰凍切片進(jìn)行油紅O染色,石蠟切片進(jìn)行HE染色。
結(jié)果:
1、小鼠MHV-A59病毒感染后1-2d開始出現(xiàn)病毒感染癥狀,死亡高峰出現(xiàn)在第3~5d,按Reed-Mueneh公式計算LD50=10-5.5,故選用10-6的病毒濃度進(jìn)行實驗。
2、小鼠一般狀況和體質(zhì)量變化結(jié)果:MHV-A59病毒感染導(dǎo)致小鼠食欲下降和體質(zhì)量降低,而高脂飲食合并病毒感染更加重小鼠食欲下降和體質(zhì)量降低。
7、3、小鼠血清MHV抗體檢測結(jié)果顯示:高脂病毒組和病毒組小鼠血清MHV抗體強(qiáng)陽性,對照組和高脂組陰性。
4、小鼠血清脂質(zhì)水平變化結(jié)果顯示:各組間TG與HDL-C水平無差異;與對照組相比,高脂組和高脂病毒組的TC水平增高,差異顯著(P<0.05),病毒組的TC水平也高于對照組,但差異不顯著;與對照組相比,高脂組和高脂病毒組的LDL-C水平增高,差異顯著(P<0.01),高脂病毒組LDL-C水平高于高脂組(P<0.05)。
8、> 5、小鼠轉(zhuǎn)氨酶水平變化結(jié)果:與對照組相比,其余3組的ALT和AST水平均顯著增高(P<0.01)。
6、小鼠肝臟HE染色結(jié)果:對照組小鼠肝細(xì)胞索以中央靜脈為中心向四周呈放射狀排列,肝小葉結(jié)構(gòu)清晰,細(xì)胞間緊密聯(lián)系;肝細(xì)胞核大而圓,核仁明顯,胞質(zhì)均勻豐富;匯管區(qū)無炎性浸潤。高脂組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)尚清晰,肝細(xì)胞腫脹、胞質(zhì)疏松呈現(xiàn)空泡狀改變(肝細(xì)胞脂肪變性),少見炎癥細(xì)胞浸潤。病毒組及高脂病毒組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)稍紊亂,可見不
9、同程度的肝細(xì)胞腫脹、胞質(zhì)疏松,胞質(zhì)空泡狀改變;可見灶性壞死、碎片樣壞死甚至橋接壞死,匯管區(qū)淋巴細(xì)胞浸潤;高脂病毒組肝細(xì)胞還可見氣球樣變(肝細(xì)胞脂肪變性)。
7、小鼠肝組織冰凍切片油紅O染色結(jié)果:對照組小鼠肝細(xì)胞核呈藍(lán)色,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)無紅染物質(zhì);高脂組肝細(xì)胞內(nèi)存在彌漫性較粗大的紅染脂滴;病毒組肝細(xì)胞內(nèi)脂滴比高脂組少而細(xì)小;高脂病毒組肝細(xì)胞內(nèi)脂滴比高脂組更密集且更粗大。用Motic Med專業(yè)醫(yī)學(xué)圖像軟件分析油紅O染色圖像,計算肝
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