光老化成纖維細胞分泌的細胞外基質(zhì)促進HaCaT細胞增殖的分子機制研究.pdf

1、UVB是日光中的內(nèi)源成分之一，它可穿透表皮，到達主要包含纖維細胞和ECM的真皮上層。皮膚活檢提示老年人比年輕人有更多的衰老成纖維細胞。而且體外實驗也發(fā)現(xiàn)反復的UVB輻射可導致HSFs發(fā)生UVB應激誘導的過早衰老(stress-induced prematuresenescence SIPS)。皮膚成纖維細胞(HSFs)的一個重要的功能是維持組織中ECM的穩(wěn)態(tài)，反復UVB輻射可影響}tSFs功能，進而改變ECM。 至今仍未見UVB

2、導致的：ECM改變?nèi)绾斡绊懮掀ぜ毎纳飳W過程的相關(guān)研究，例如：存活、增殖、遷移、分化以及細胞內(nèi)信號傳導。目光性皮膚腫瘤的發(fā)生是從活化細胞到前腫瘤皮損，最終發(fā)展為惡性皮損。上述的生物學功能改變在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展的過程中起重要作用。 現(xiàn)有的幾個研究揭示了衰老和腫瘤發(fā)生的關(guān)系，其中指出多種應激誘導的衰老成纖維細胞可促進前腫瘤細胞和腫瘤細胞的增殖，卻不能刺激正常上皮細胞增殖。這一作用是通過分泌可溶性細胞因子、細胞外基質(zhì)(ECM)和直接

3、的細胞間相互作用。其中，ECM占到至少40％的刺激效應。連續(xù)UVB照射誘導的衰老HSFs具有和其他應激誘導的衰老成纖維細胞相似的分泌表型，特別是某些ECM成分的增加，如：某些膠元蛋白(collagens)、纖粘蛋白(fibronectin)和骨橋素(osteonectin)等。然而，UVB-SCIP成纖維細胞分泌的ECM是否具有相似的促進增殖的效應仍然未有相關(guān)研究。 HaCaT細胞是人類的前腫瘤角質(zhì)細胞，其獲得了某些腫瘤易感性突

4、變，但不能在體內(nèi)形成實體腫瘤。因此是研究皮膚腫瘤形成的通用模式細胞。研究ECM對HaCaT的效應可更好的了解其促腫瘤機制。同時，兩個已建立的模型為我們的研究提供了實驗基礎(chǔ)，其中之一是反復UVB輻射誘導人皮膚成纖維細胞(HSFs)的衰老模型；其二是HSFs生成的ECM的制備。 之前的研究提示衰老的成纖維細胞分泌的ECM可促進HaCaT細胞的增殖和加速細胞進程。雖然導致這一效應的分子基礎(chǔ)并不清楚，但現(xiàn)有研究提示在ECM和許多類型上皮

5、細胞作用中ERK1/2和P13K/AKT信號通路在其中扮演重要的存活和促增殖的角色。因此我們假設(shè)HaCaT黏附于皮膚成纖維細胞分泌的ECM可活化P13K/AKT和MAPK家族的成員如：ERK1/2，然后觀察這些信號分子的活化程度和時相性變化。在此基礎(chǔ)上，進一步去探詢相關(guān)的上游信號。其中，我們重點觀察黏著斑激酶(FAK)，它是一個125kD的酪氨酸激酶(PTK)，在胞膜內(nèi)側(cè)與整合素共定位，并在整合素介導的信號傳導中扮演重要的角色。在ECM

6、和整合素受體結(jié)合后被活化，進而激活下游的P13K/AKT和RAS-RAF-ERK1/2。 在以上理論的基礎(chǔ)上，我們假設(shè)成纖維細胞分泌的ECM可通過活化ERK和P13K/AKT信號通路促進細胞增殖。我們的研究提供證據(jù)證實了這一假設(shè)。靶向性干預這些信號有助于預防和治療慢性日光源性皮膚腫瘤。 方法：1)連續(xù)給予未衰老成纖維細胞亞細胞毒劑量(15mJ/cm2)UVB輻射5次，根據(jù)SA-βgal染色和DNA合成等指標鑒定成纖維細胞

7、是否發(fā)生衰老。將衰老和未衰老的成纖維細胞接種到平皿中，然后在無血清培養(yǎng)基中育三天產(chǎn)生完整的細胞層，EDTA處理掉上層細胞，保留下層的細胞外基質(zhì)。 2)隨后將預懸浮處理的HaCaT細胞接種到預包被ECM的平皿中，細胞在EGF-free KBM培養(yǎng)基中孵育。接種后36小時收集細胞，流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡比率。在低密度接種HaCaT細胞96小時后，采用MTT法檢測細胞的增殖水平。 3)HaCaT細胞接種到預包被ECM的平

8、皿中，細胞在EGF-free KBM培養(yǎng)基中孵育。在接種后不同時間點收集細胞，Westem blot法檢測FAK、ERK1/2和AKT磷酸化水平的變化。 4)在實驗中預先采用細胞松弛素D，U0126 and wortmaninn分別處理細胞，接種后36小時收集細胞，流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡比率。在低密度接種HaCaT細胞96小時后，采用MTT法檢測細胞的增殖水平。在接種后不同時間點收集細胞，Western blot法檢測FA

9、K、ERK1/2和AKT磷酸化水平的變化。 結(jié)果: 1)給予皮膚成纖維細胞連續(xù)的亞細胞毒劑量的UVB輻射，可誘導細胞穩(wěn)定出現(xiàn)衰老相關(guān)的標記，如：衰老相關(guān)的半乳糖苷酶活性增高。并制備出由UVB應激誘導的成纖維細胞和未衰老成纖維細胞分泌的細胞外基質(zhì)包被的平皿。 2)結(jié)果顯示UVB-SIPS成纖維細胞分泌的ECM較未衰老成纖維細胞分泌的ECM和空白ECM的促增殖效果分別高13.15％and 29.27％(p<0.05)

10、?？瞻譋CM組、未衰老ECM組和UVB-SIPS ECM組測得發(fā)生平均4.01％，5.47％和7.12％的凋亡。與空白組比較，未衰老ECM組和UVB-SIPS組細胞S期的比例分別增高23.68％和8.55％(P<0.05)。 3)實驗發(fā)現(xiàn)HaCaT細胞粘附于ECM(空白組、未衰老ECM組、UVB-SCIP ECM組)時，可時間依賴性的激活FAK和ERK1/2，兩者磷酸化水平在30分鐘開始升高，在120分鐘達到高峰，來源于UVB-

11、SIPS成纖維細胞的ECM可誘導最快而強烈的ERK1/2和FAK的活化； AKT無論在懸浮或貼壁的情況下均有輕度的磷酸化，而且三組中似乎未見顯著的差異。在細胞粘附中，時相性AKT僅發(fā)生輕微增加。 4)U0126預處理可完全阻斷三組細胞的ERK磷酸化，阻斷ERK信號途徑完全抑制了ECM的促進增殖的效應； wortmanmin預處理顯著增加三組的凋亡率，分別為15.8％、23.4％和21.8％； 2μM細胞松弛素D可抑制細胞-ECM

12、相互作用誘導的AKT磷酸化，并明顯減少了FAK磷酸化水平，同時細胞的凋亡率顯著增加，從而抑制ECM對細胞增殖的促進作用。 結(jié)論: 1)本研究顯示反復亞細胞毒劑量的UVB應激可導致成纖維細胞衰老，這一模型的建立為研究UVB應激誘導的衰老是否具有促進上皮細胞增殖以及光老化的促腫瘤機制提供了可能。 2)結(jié)果提示UVB-SCIP成纖維細胞分泌的ECM可以更強的促進HaCaT細胞的增殖，此效應更多依賴加快細胞倍增，而不是減

13、少細胞的凋亡。 3)來源于UVB-SIPS成纖維細胞的ECM可誘導最快而強烈的ERK1/2和FAK.的活化，就AKT’來看，三組中均可觀察到輕度活化，但這種差異并無顯著性。 4)ERK1/2信號途徑是通過加速細胞進程促進細胞的增殖，而不是減少失巢和EGF-free誘導的凋亡；細胞粘附中，時相性AKT僅發(fā)生輕微增加，這種輕度但可檢測到的AKT活化仍然具有生物學活性，在本系統(tǒng)中P13-K/AKT是一個重要的抗凋亡信號通路，該