Hedgehog-Gli信號通路介導(dǎo)肝細(xì)胞癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用及芍藥苷對其的影響.pdf

1、原發(fā)性肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)為最常見的惡性腫瘤之一,死亡率居全球惡性腫瘤的第三位。其治愈率低,預(yù)后差,HCC的發(fā)生、發(fā)展極其快速隱匿,多數(shù)患者確診即為晚期,且病程發(fā)展迅速,中位生存時間僅為數(shù)月。肝炎病毒,黃曲霉素,酒精等是HCC的主要誘因。侵襲與轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致其復(fù)發(fā)和治療失敗的主要原因。目前,HCC侵襲與轉(zhuǎn)移的確切機(jī)制尚不明確。
　　Hedgehog/Gli信號通路在哺乳動物胚胎的生長發(fā)育

2、中極為重要,它控制著脊椎動物內(nèi)胚層分化發(fā)育,是一個高度保守的中軸器官發(fā)育的形態(tài)發(fā)生通路。該信號通路與人類腫瘤的發(fā)生與發(fā)展關(guān)系亦為緊密,該信號異常激活最早在痣樣基底細(xì)胞癌綜合征中被證實(shí),其后在基底細(xì)胞癌、胃癌、結(jié)直腸癌、食管癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌,卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌及肝癌等腫瘤中也相繼被發(fā)現(xiàn)。
　　Hedgehog/Gli信號通路的異常激活在HCC的發(fā)病中發(fā)揮了重要作用。信號通路的glioma-associated on

3、cogene homolog(Gli),Patched(Ptch),Smoothened(Smo)在肝癌組織中表達(dá)明顯高于非腫瘤性肝組織,而該通路的抑制蛋白Hip1在肝癌組織中表達(dá)明顯低于非腫瘤性肝組織;一些肝癌細(xì)胞株也存在該通路的異常表達(dá)與激活而參與肝細(xì)胞癌的增殖、凋亡等過程,該通路的抑制如KAAD-cyclopamin(KAAD-cyc),Gli siRNA等則減少了肝癌細(xì)胞的凋亡與增殖;Smo siRNA敲除Smo后同樣阻礙了肝癌

4、細(xì)胞的體內(nèi)外的生長;同時Hedgehog信號通路還參與了HCC干細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。同時該信號通路對多種類型細(xì)胞轉(zhuǎn)移與遷移的控制及血管形成發(fā)揮重要作用,該信號通路還參與了神經(jīng)膠質(zhì)瘤、卵巢癌、胃癌、食管癌、胰腺癌、前列腺癌等腫瘤的再生、侵襲與轉(zhuǎn)移。但該信號通路參與HCC的侵襲與轉(zhuǎn)移的作用及機(jī)制未見系統(tǒng)報道。
　　天然藥物在腫瘤的治療中發(fā)揮著十分重要的作用。白芍是治療肝病的重要組方之一,近年來對其保肝作用的研究逐漸增多。白芍的有效部位白芍

5、總苷(Total glucosides of paeony,TGP)對免疫性肝纖維化大鼠有顯著的治療作用,同時TGP通過細(xì)胞周期阻滯,抑制肝癌細(xì)胞HepG2和SMMC-7721的增殖和凋亡。芍藥苷(Paeoniflorin,Pae)是TGP的主要活性成分,但Pae對HCC侵襲轉(zhuǎn)移的影響未見報道。
　　基于以上的認(rèn)識,本研究擬探討Hedgehog/Gli通路介導(dǎo)HCC的侵襲轉(zhuǎn)移作用及其可能的機(jī)制;同時考察Pae對HCC侵襲轉(zhuǎn)移的影響

6、及對HCC中Hedgehog/Gli通路的干預(yù)作用。以探討HCC的侵襲轉(zhuǎn)移新機(jī)制,尋求HCC治療新靶點(diǎn),并針對該靶點(diǎn)尋找有效抑制HCC侵襲轉(zhuǎn)移的抑制劑。
　　目的:
　　1.考察Hedgehog/Gli通路介導(dǎo)HCC侵襲轉(zhuǎn)移的作用;
　　2.探討Hedgehog/Gli通路介導(dǎo)HCC侵襲轉(zhuǎn)移的可能機(jī)制;
　　3.考察Pae對HCC侵襲轉(zhuǎn)移的影響;
　　4.探討Pae抑制HCC侵襲轉(zhuǎn)移的可能機(jī)制。
　　

7、方法:
　　1.免疫組化檢測正常肝組織、轉(zhuǎn)移或非轉(zhuǎn)移HCC患者肝組織以及人肝細(xì)胞癌Bel-7402細(xì)胞中Shh,Gli-1,p-ERK1/2和MMP-9的蛋白表達(dá);
　　2.Spearman相關(guān)檢驗(yàn)分析HCC肝癌組織Shh,Gli-1,p-ERK1/2和MMP-9蛋白與HCC臨床病理參數(shù)的相關(guān)性,同時分析肝細(xì)胞癌肝組織中Gli-1,p-ERK1/2和MMP-9三者之間的相關(guān)性;
　　3.Wound-healing劃痕實(shí)

8、驗(yàn)檢測通路配體Shh,通路抑制劑KAAD-cyc,MAPK通路的抑制劑U0126和PD98059及Pae對人肝癌Bel-7402細(xì)胞轉(zhuǎn)移運(yùn)動能力的影響;4.Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測Shh,KAAD-cyc,U0126,PD98059及Pae對人肝癌Bel-7402細(xì)胞侵襲能力的影響;
　　5.細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)檢測Shh,KAAD-cyc,U0126,PD98059及Pae對人肝癌Bel-7402細(xì)胞粘附能力的影響;
　　6

9、.MTT法檢測Pae對肝癌Bel-7402細(xì)胞增殖能力的影響;
　　7.Western blot檢測Shh,KAAD-cyc,U0126,PD98059及Pae對人肝癌Bel-7402細(xì)胞Shh,Gli-1,p-ERK1/2及MMP-9蛋白表達(dá)的影響。
　　結(jié)果:
　　1.與未侵襲轉(zhuǎn)移性HCC組比較,Shh,Gli-l蛋白在侵襲轉(zhuǎn)移性HCC肝癌組織表達(dá)顯著增加,Shh和Gli-1在非轉(zhuǎn)移性肝細(xì)胞癌的陽性率為57.14％

10、和44.90%,二者在轉(zhuǎn)移性肝細(xì)胞癌的陽性率均升高到81.08%。同時侵襲轉(zhuǎn)移性HCC肝癌組織中p-ERK1/2,MMP-9蛋白的表達(dá)也顯著增加,差異有顯著性,而正常肝組織中幾乎不表達(dá)Shh,Gli-1,p-ERK1/2和MMP-9蛋白;
　　2.肝癌組織Shh,Gli-1,p-ERK1/2和MMP-9蛋白的表達(dá)與HCC的侵襲轉(zhuǎn)移的密切相關(guān)(P=0.035,0.001,0.001,0.008);肝癌組織中Shh,Gli-1和p-E

11、RK1/2蛋白表達(dá)還與肝癌分化程度具有負(fù)相關(guān)(P=0.004,0.034,0.042);同時肝癌組織中Gli-1與p-ERK1/2,Gli-1與MMP-9之間具有相關(guān)性(P=0.031,P=0.034);
　　3.Shh(0.13μg·mL-1,0.5μg·mL-1)能明顯增加肝癌細(xì)胞Bel-7402的侵襲、轉(zhuǎn)移及粘附;
　　4.KAAD-cyc(1μmol·L-1,4μmol·L-1)則顯著減少了肝癌細(xì)胞Bel-7402的

12、侵襲、轉(zhuǎn)移及粘附;
　　5.U0126(5μmol·L-1,10μmol·L-1)和PD98059(5μmol·L-1,10μmol·L-1)均明顯抑制了肝癌細(xì)胞Bel-7402侵襲與轉(zhuǎn)移;
　　6.Shh(0.13μg·mL-1,0.5μg·mL-1)顯著增加了肝癌細(xì)胞Bel-7402的Gli-1,p-ERK1/2及MMP-9的蛋白表達(dá);
　　7.KAAD-cyc(1μmol·L-1,4μmol·L-1)明顯減少了肝

13、癌細(xì)胞 Bel-7402中 Gli-1, p-ERK1/2及MMP-9的蛋白表達(dá);
　　8.U0126(5μmol·L-1,10μmol·L-1)和PD98059(5μmol·L-1,10μmol·L-1)均明顯抑制了肝癌細(xì)胞Bel-7402中p-ERK1/2,MMP-9的蛋白表達(dá),但二者對肝癌細(xì)胞Bel-7402 Gli-1蛋白表達(dá)均無顯著影響;
　　9.芍藥苷(6.25μmol·L-1,12.5μmol·L-1,25μm

14、ol·L-1)明顯減少了肝癌細(xì)胞Bel-7402的侵襲、轉(zhuǎn)移及粘附,同時顯著減少肝癌細(xì)胞Bel-7402中Gli-1,p-ERK1/2及MMP-9的蛋白表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　1.Hedgehog/Gli信號通路參與了HCC的侵襲轉(zhuǎn)移;
　　2.Hedgehog/Gli信號通路參與HCC的侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制可能與該通路激活后,上調(diào)MAPK/ERK信號通路、增加MMP-9蛋白的表達(dá)有關(guān);
　　3.Pae能顯著抑制HCC