DDAH在調節(jié)神經細胞分化及介導藥物抗神經細胞凋亡中的作用及機制研究.pdf

1、一氧化氮(nitric oxide,NO)合酶(nitric oxide synthase,NOS)/NO與神經細胞分化密切相關。二甲基精氨酸二甲胺水解酶(dimethylarginine dimethylaminohydrolase,DDAH)能特異性水解內源性NOS抑制物非對稱二甲基精氨酸(asymmetric dimethylarginine,ADMA),上調NOS活性。DDAH廣泛存在于各種細胞和心血管、神經系統(tǒng)組織中。目前認為

2、其活性降低所致的ADMA代謝減少與多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關,是一個新的心血管疾病相關蛋白和藥物防治靶點。新近研究發(fā)現,舌下運動神經損傷后DDAHmRNA的水平明顯升高,同型半胱氨酸(Homocysteine,Hcy)可顯著降低神經細胞DDAH的表達和活性并增加ADMA的水平,提示DDAH可能與神經系統(tǒng)發(fā)育或某些神經系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關。
　　本論文將從分子細胞水平系統(tǒng)研究DDAH在神經細胞分化和凋亡中的作用,并探討D

3、DAH/ADMA通路是否介導3,4,5,6-四羥基(口山)酮和全反式維甲酸(all-trans retinoic acid,atRA)的抗凋亡作用。
　　主要研究工作如下:在神經生長因子(nerver growth factor,NGF)誘導PC12神經細胞分化的體外模型,利用基因轉染技術沉默或過表達DDAH1基因,系統(tǒng)探討DDAH1調節(jié)神經細胞分化的作用及分子機制。結果顯示:NGF(50 ng/ml)能誘導神經細胞分化,增加NO

4、水平、DDAH1、nNOS mRNA及蛋白表達,并呈時間依賴性;NGF降低DDAH2mRNA和蛋白表達;NGF對DDAH活性和ADMA水平無明顯影響;L-NAME能抑制NGF誘導的神經細胞分化和NO水平,但不影響DDAH1及DDAH2的表達。沉默DDAH1可抑制NGF誘導的神經細胞分化及其標志性蛋白微管相關蛋白(microtubule-associatedprotein2,MAP2)的表達,同時抑制nNOS mRNA的表達;而過表達DD

5、AH1誘導神經細胞分化,增加G0/G1期細胞百分比,增加nNOSmRNA的表達,L-NAME能抑制過表達DDAH1誘導的神經細胞分化。
　　(口山)酮是普遍存在于植物中的一類多酚類化合物。具有強效的抗氧化、抗炎作用。某些(口山)酮單體對血管內皮功能的保護作用與升高DDAH活性從而降低內源性ADMA水平有關。3,4,5,6-四羥基(口山)酮是我校藥學院藥物化學系合成的新型(口山)酮單體化合物。我室前期工已證明,3,4,5,6-四羥基

6、(口山)酮對缺血心肌及血管內皮具有保護作用,其機制與抑制氧化應激有關?；贏β所致神經細胞凋亡與氧化應激密切相關及3,4,5,6-四羥基(口山)酮具有抗氧化特性,本實驗采用Aβ25-35誘導PC12神經細胞損傷建立阿爾茨海默病(Alzheimers disease,AD)的細胞模型,研究3,4,5,6-四羥基(口山)酮對Aβ25-35所致PC12細胞凋亡的保護作用,并探討其機制是否與DDAH/ADMA途徑有關。結果顯示:10μM Aβ2

7、5-35與PC12神經細胞孵育48 h能顯著增加細胞凋亡率;Aβ25-35處理PC12細胞3 h后逐漸增加ROS水平和caspase-3活性,抗氧化劑PDTC(5μM)或caspase-3活性抑制劑DEVD-CHO(100μM)能顯著抑制Aβ25-35誘導的凋亡;(口山)酮(3,10或30μM)能顯著抑制Aβ25-35誘導的細胞凋亡,ROS水平和caspase-3活性的增加。Aβ25-35處理PC12神經細胞6 h后能顯著降低DDAH活

8、性和增加ADMA水平,(口山)酮(3,10或30μM)能顯著抑制Aβ25-35誘導的上述作用。ADMA濃度和時間依賴性的誘導細胞凋亡;ADMA(10μM)處理PC12細胞3 h后逐漸增加ROS水平和caspase-3活性,抗氧化劑PDTC(5μM)或caspase-3活性抑制劑DEVD-CHO(100μM)能顯著抑制ADMA誘導的細胞凋亡。
　　atRA在調控細胞生長、分化、凋亡等生命活動中起重要作用。atRA通過與維甲酸受體(r

9、etinoic acid receptor,RAR)和維甲類受體(retinoid X receptor,RXR)結合,從而啟動一系列靶基因的轉錄。其中DDAH2的啟動子區(qū)含有維甲酸反應元件。新近研究發(fā)現,在培養(yǎng)的內皮細胞atRA能上調DDAH2的表達。本研究將探討CoCl2誘導的PC12神經細胞調亡是否涉及DDAH/ADMA通路及atRA是否通過上調DDAH2表達抑制CoCl2誘導的神經細胞凋亡。結果顯示:125μM CoCl2與PC

10、12神經細胞孵育48 h能顯著增加細胞凋亡率;CoCl2處理PC12細胞3 h后逐漸增加ROS水平和caspase-3活性;atRA(0.1,1 or 10μM)能顯著抑制CoCl2誘導的細胞凋亡、ROS水平與caspase-3的活性的增加;抗氧化劑PDTC(5μM)或caspase-3活性抑制劑DEVD-CHO(100μM)能顯著抑制CoCl2誘導的凋亡。CoCl2處理PC12神經細胞6 h后能顯著降低DDAH活性和增加ADMA水平;