小鼠Mageb18基因克隆、表達(dá)分析及其調(diào)節(jié)黑色素瘤B16-F0細(xì)胞惡性表型的初步研究.pdf

1、黑色素瘤相關(guān)抗原(melanoma-associated antigens，MAGE)是一個(gè)多成員基因家族。目前在人、大鼠和小鼠中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的MAGE基因約100個(gè)左右。所有的MAGE基因其蛋白序列中都有一個(gè)含200個(gè)氨基酸左右的結(jié)構(gòu)域，稱為MAGE同源結(jié)構(gòu)域(MHD)。根據(jù)MAGE基因序列保守性的不同，這些基因可以分為多個(gè)不同的亞家族。另外，根據(jù)表達(dá)譜的不同，MAGE基因還可以分為Ⅰ型和Ⅱ型兩類。Ⅰ型MAGE基因由MAGE-A、-B和-

2、C三個(gè)亞家族組成，其他的亞家族則都屬于Ⅱ型MAGE基因。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，Ⅰ型MAGE基因在許多不同類型的腫瘤組織和細(xì)胞中表達(dá)，但是在正常組織中只有睪丸、卵巢和胎盤表達(dá)。正好相反，Ⅱ型MAGE基因卻在許多正常組織中廣譜表達(dá)。因?yàn)椴G丸、卵巢和胎盤中HLA分子的表達(dá)水平很低，因此Ⅰ型MAGE基因獨(dú)特的表達(dá)特點(diǎn)使得它們成為腫瘤免疫治療的理想靶標(biāo)。目前，針對(duì)Ⅰ型MAGE基因已經(jīng)開發(fā)了許多不同類型的腫瘤疫苗，有的甚至已經(jīng)開始進(jìn)入臨床試驗(yàn)。但是，由于對(duì)Ⅰ型

3、MAGE基因的表達(dá)譜及功能的研究相對(duì)較少，因此這在很大程度上限制了MAGE腫瘤疫苗的推廣和應(yīng)用。
　　 雖然有研究表明，Ⅰ型MAGE基因在正常組織中的表達(dá)是睪丸特異的，但是我們前期利用表達(dá)序列標(biāo)簽(expressed sequence tag，EST)序列都對(duì)應(yīng)于小鼠Mageb18基因。據(jù)此，我們假設(shè)認(rèn)為，小鼠Mageb18基因在正常組織中的表達(dá)不是睪丸特異的，而是廣譜的。本課題的目的就是克隆小鼠的Magebl8基因，分析它的表

4、達(dá)特征以及調(diào)控機(jī)制，并研究它在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞惡性表型方面的功能以及相關(guān)分子機(jī)制。
　　 為此，我們首先借助生物信息學(xué)工具分析和預(yù)測(cè)了Mageb18基因的結(jié)構(gòu)和功能。結(jié)果表明，小鼠Mageb18基因全長(zhǎng)2160bp，由5個(gè)外顯子組成。它最大的開放閱讀框?yàn)?84bp，編碼蛋白含327個(gè)氨基酸，蛋白的理論分子量和等電點(diǎn)分別為37203.31 Da和6.43。MAGEB18蛋白含有一個(gè)MAGE N-末端結(jié)構(gòu)域和一個(gè)保守的MHD，分別位于A

5、rg3-Asp82和he91-Ala289。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)表明，MAGEB18蛋白不含亞細(xì)胞定位序列，但是可能存在8個(gè)磷酸化位點(diǎn)和一個(gè)N-豆蔻?；稽c(diǎn)，提示MAGEB18可能是一個(gè)胞漿蛋白，并且存在翻譯后修飾加工。以前的研究表明，Ⅰ型MAGE基因主要定位在X染色體，而且同一亞族的基因往往形成相對(duì)獨(dú)立的基因簇。染色體定位分析發(fā)現(xiàn)，小鼠Mageb18基因也定位在X染色體的C2-C3區(qū)域，并與其他多個(gè)MAGE-B亞家族的基因形成基因簇。而且系

6、統(tǒng)進(jìn)化樹分析也表明，Mageb18基因與MAGE-B亞家族基因間的親緣關(guān)系最近。此外，基因同源搜索則發(fā)現(xiàn)，Mageb18基因在高等哺乳動(dòng)物中高度保守，而在哺乳動(dòng)物以外的物種中不存在。這些結(jié)果集中提示，Mageb18基因是一個(gè)在高級(jí)哺乳動(dòng)物中高度保守的Ⅰ型MAGE基因。
　　 接下來，RT-PC分析Mageb18基因的表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)，小鼠Mageb18基因在正常組織中的表達(dá)確實(shí)是非睪丸特異的。除了睪丸以外，它在胃、大腸、小腸、脾臟、淋

7、巴結(jié)、骨髓和外周淋巴細(xì)胞都有較高水平表達(dá)。另外，我們發(fā)現(xiàn)Mageb18基因在小鼠睪丸中的表達(dá)是發(fā)育相關(guān)的。它在出生后第1天的睪丸中開始表達(dá)，而且隨著時(shí)間的進(jìn)行它的表達(dá)逐漸增高，在第21天左右達(dá)到最高，此后一直維持在較高的表達(dá)水平，提示Mageb18可能與睪丸的發(fā)育和精子的形成有關(guān)。繼續(xù)分析Mageb18基因在小鼠細(xì)胞株中的表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)，Mageb18在成纖維瘤細(xì)胞L929、黑色素瘤細(xì)胞B16-F0、肝癌細(xì)胞MM45T.Li、乳腺癌細(xì)胞4T

8、1、胚胎成纖維細(xì)胞NIH3T3和巨噬細(xì)胞RAW264.7中表達(dá)，而在肝癌細(xì)胞H22和腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6中不表達(dá)。但是DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮-2’-脫氧胞苷和組蛋白去乙酰化酶抑制劑曲古霉素A能夠激活Mageb18陰性細(xì)胞H22和C6中Mageb18基因的表達(dá)，提示表觀遺傳機(jī)制調(diào)節(jié)Mageb18的轉(zhuǎn)錄激活。
　　 然后，利用Western印跡分析HEK293中瞬時(shí)表達(dá)的HA-MAGEB18融合蛋白表明，小鼠Mageb18基因編碼

9、的蛋白大小約為46 kDa。進(jìn)一步分析小鼠正常組織中內(nèi)源性MAGEB18蛋白則發(fā)現(xiàn)，MAGEB18蛋白在小鼠的胃、大腸、小腸、脾臟、淋巴結(jié)、骨髓和血液淋巴細(xì)胞中表達(dá)，而在腦、心臟、肺、肝臟和腎臟中不表達(dá)，提示在正常組織中MAGEB18蛋白的表達(dá)譜與其mRNA的表達(dá)譜完全一致。另外，在組織中全長(zhǎng)MAGEB18蛋白大小也為46 kDa左右，但是它可能存在翻譯后的剪切加工，從而產(chǎn)生一條大小約為26 kDa的片段。奇怪的是，小鼠細(xì)胞株中的內(nèi)源性

10、MAGEB18蛋白只存在大小為46 kDa一種形式。這些結(jié)果提示，MAGEB18蛋白在小鼠組織和細(xì)胞株中可能存在不同的翻譯后修飾，從而導(dǎo)致形成大小不同的蛋白產(chǎn)物。利用間接免疫熒光分析.MAGEB18蛋白的亞細(xì)胞定位表明，小鼠MAGEB18蛋白主要定位在細(xì)胞漿中，但在不同細(xì)胞株的細(xì)胞核里也有或多或少的定位。免疫組化分析進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，在睪丸組織中MAGEB18蛋白主要在具有增殖能力的初級(jí)和次級(jí)精原細(xì)胞的細(xì)胞漿中表達(dá)，但是在成熟的精子中不表達(dá)。

11、這些結(jié)果提示，MAGEB18蛋白是一個(gè)胞漿蛋白，它可能與細(xì)胞的增殖表型有關(guān)。
　　 接下來，為了闡明Mageb18基因的功能，我們通過siRNA技術(shù)干擾內(nèi)源性MAGEB18基因的表達(dá)，定量RT-PCR和Western印跡分析表明siRNA能夠有效抑制細(xì)胞中Mageb18基因在mRNA和蛋白水平的表達(dá)。隨后我們通過生長(zhǎng)曲線分析、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)以及皮下成瘤實(shí)驗(yàn)證明，干擾Mageb18基因的表達(dá)能夠顯著抑制B16-F0細(xì)胞和4T1細(xì)

12、胞體外和體內(nèi)的增殖。Annexin-V-APC/7-AAD細(xì)胞凋亡分析發(fā)現(xiàn)，干擾Mageb18能夠顯著增強(qiáng)B16-F0細(xì)胞的凋亡。Western印跡分析則表明，這個(gè)細(xì)胞凋亡增強(qiáng)的過程可能與TP53通路有關(guān)，因?yàn)楦蓴_MAGEB18蛋白的表達(dá)能夠提高TP53的蛋白水平，同時(shí)激活TP53的靶基因p21和Bax。
　　 最后，進(jìn)一步分析Mageb18基因在小鼠細(xì)胞株中的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，MAGEB18蛋白在高成瘤和高轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞株，包括腫瘤干

13、細(xì)胞和前癌干細(xì)胞中表達(dá)，提示Mage18基因不僅與細(xì)胞增殖表型有關(guān)，而且可能還調(diào)節(jié)細(xì)胞的轉(zhuǎn)移特性。為此，我們通過劃痕實(shí)驗(yàn)、基質(zhì)膠侵襲實(shí)驗(yàn)以及體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型分析了Mageb18基因?qū)16-F0細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性的影響。結(jié)果表明，干擾MAGEB18蛋白的表達(dá)能夠顯著抑制B16-F0細(xì)胞的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移能力?；|(zhì)金屬蛋白酶家族在腫瘤的遷移和轉(zhuǎn)移中扮演重要角色。我們通過RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，B16-F0細(xì)胞表達(dá)多種不同類型的MMPs。但是，干擾

14、Mageb18基因以后只能特異性地下調(diào)MMP2和MMP9的表達(dá)，而其他MMP的表達(dá)卻沒有明顯的差異。這些結(jié)果提示，Mageb18基因確實(shí)可以通過MMP2和MMP9調(diào)節(jié)B16-F0細(xì)胞的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移。
　　 總之，我們的工作首次證明小鼠Mageb18基因一個(gè)非睪丸特異表達(dá)的Ⅰ型MAGE基因。我們的結(jié)果提示，某些Ⅰ型MAGE基因，至少是Mageb18基因的表達(dá)并不像傳統(tǒng)觀點(diǎn)所認(rèn)為的那樣是睪丸特異的，而是廣譜的。由于MAGE家族基