HDAC3和NCoR介導了Ataxin-3缺失誘導的轉錄異常.pdf

1、本文主要從Ataxin-3敲除導致基因表達譜改變、EphA3基因啟動子區(qū)域定位表達及活性分析、HDAC3和NCoR介導了ataxin-3對EphA3基因的轉錄調控三個方面進行了論述。
　　第一部分:Ataxin-3敲除導致基因表達譜改變
　　目的:采用基因表達芯片技術(Microarray)觀察ataxin-3敲除對基因表達變化的影響。
　　方法:選取ataxin-3敲除的小鼠胚胎成纖維細胞(ataxin-3 KO M

2、EF)和正常小鼠胚胎成纖維細胞(ataxin-3 WT MEF)為研究對象,提取RNA并用基因表達譜芯片技術觀察ataxin-3敲除對基因表達的影響,所得實驗結果數(shù)據(jù)經ThomsonReuters/GeneGo公司的生物信息學軟件進行分析,并采用逆轉錄實時定量PCR技術證實基因表達芯片結果的可靠性。
　　結果:與正常細胞相比,ataxin-3敲除導致410個基因表達明顯異常(基因表達信號上調或下調超過2倍及以上),其中260個基因

3、表達上調,而150個基因表達下調。GeneGo軟件分析這410個基因的生物學功能,并對其功能進行分類。發(fā)現(xiàn)ataxin-3敲除導致多個細胞通路轉錄異常,尤其是炎癥免疫和細胞粘附相關基因。
　　結論:Ataxin-3分子丟失導致多種細胞通路相關基因轉錄異常。
　　第二部分:EphA3基因啟動子區(qū)域定位表達及活性分析
　　目的:構建含有不同長度EphA3基因啟動子片段的報告基因載體,研究其在293T細胞和MEF細胞中的轉錄

4、活性。
　　方法:以Balb/C小鼠基因組DNA為模板,擴增不同長度的EphA3基因啟動子片段,并克隆進入熒光素酶報告基因質粒pGL3-Basic真核表達載體內。酶切鑒定及基因測序無誤后,將重組質粒和pRL-CMV內對照質粒共轉染293T或MEF細胞,分析不同長度的EphA3基因啟動子片段的轉錄活性。
　　結果:酶切鑒定和基因測序結果提示表達載體構建成功,EphA3基因的核心啟動子區(qū)域位于-279～+110bp之間,在293

5、T細胞和MEF細胞中啟動子片段的轉錄活性相似。
　　結論:成功構建了熒光素酶報告基因重組質粒,并確定了EphA3基因的核心啟動子區(qū)域。
　　第三部分:HDAC3和NCoR介導了ataxin-3對EphA3基因的轉錄調控
　　脊髓小腦共濟失調3型(SCA3)是多聚谷氨酸誘導神經退行性疾病的一種,其疾病基因編碼一個小分子蛋白ataxin-3。Ataxin-3蛋白外顯子區(qū)域CAG異常拷貝導致疾病的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)Ataxin-

6、3分子是一個去泛素化酶,調節(jié)某些蛋白的活性和穩(wěn)定性,是泛素-蛋白酶體的重要成分。同時,ataxin-3分子也參與細胞轉錄調控,病理性ataxin-3導致多種細胞通路基因轉錄異常,加重疾病進程。為探討正常Ataxin-3分子轉錄調控的機制,選用ataxin-3 KO MEF和ataxin-3 WT MEF細胞為研究對象?；虮磉_芯片、逆轉錄實時定量PCR和免疫印跡結果均顯示ataxin-3敲除導致EphA3基因表達明顯上調。因此構建了Ep

7、hA3基因的啟動子片段,雙熒光素酶活性測定結果發(fā)現(xiàn)ataxin-3缺失導致EphA3基因啟動子轉錄活性增強,而瞬時表達人源ataxin-3分子進入ataxin-3 KO MEF細胞內可抑制EphA3基因啟動子的轉錄活性。為闡明ataxin-3分子對EphA3基因啟動子調控的機制,采用染色體免疫共沉淀技術,結果發(fā)現(xiàn)雖然ataxin-3分子不能直接結合到EphA3啟動子區(qū)域,但可以調節(jié)EphA3啟動子區(qū)域組蛋白H3和H4乙酰化的水平。進一步

8、免疫印跡結果證實Ataxin-3丟失導致總的組蛋白H3和H4乙?；皆黾?而調節(jié)組蛋白H3和H4乙?；拿附M蛋白去乙?；?(HDAC3)和核受體共抑制因子(NCoR)的水平減少。在正常MEF細胞內給予HDAC3特異的阻斷劑可以模擬ataxin-3丟失的情況。綜上所述,的研究首次發(fā)現(xiàn),ataxin-3敲除可導致多種基因轉錄異常。Ataxin-3通過調節(jié)組蛋白去乙?；窰DAC3和NCoR的水平來調控基因啟動子區(qū)域組蛋白的乙?；?進而調