農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子CBF3轉(zhuǎn)化安祖花的研究.pdf

1、安祖花(Anthurium andreanum Lind)是天南星科單子葉植物,作為世界第二大熱帶花卉,因具有獨(dú)特的花枝,美麗的葉型而倍受人們的青睞。它原產(chǎn)于熱帶雨林地區(qū),性喜溫?zé)?好潮濕,適宜生長溫度為20-28℃。由于對溫度較敏感,安祖花在我國溫度較低的北方難以生長。因此,研究者希望通過基因工程技術(shù)提高安祖花的抗寒性。CBF3作為轉(zhuǎn)錄因子能調(diào)控下游多CRT/DRE順式作用元件COR(coldregulated)基因的表達(dá),從而提高植

2、物抗寒性。若把轉(zhuǎn)錄因子CBF3基因轉(zhuǎn)入安祖花,從而獲得在較低溫度環(huán)境中也能夠正常生長的植株,將具有一定的現(xiàn)實意義。本研究優(yōu)化了安祖花的再生體系,并建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉片和根的轉(zhuǎn)化體系。然后,將克隆到的擬南芥CBF3基因轉(zhuǎn)化安祖花外植體,PCR檢測得到了陽性愈傷組織。
　　 主要結(jié)果如下:
　　 1.建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的安祖花葉片的轉(zhuǎn)化體系。首先優(yōu)化了葉片離體培養(yǎng)條件,大幅提高了葉片的愈傷組織誘導(dǎo)率。在對安祖花葉片愈傷組織誘

3、導(dǎo)試驗中發(fā)現(xiàn),葉片的再生對NH4NO3的濃度非常敏感,低濃度的NH4NO3有利于愈傷組織的誘導(dǎo),濃度較高時抑制愈傷組織的誘導(dǎo)；而不同的碳源也會影響愈傷組織的誘導(dǎo),蔗糖與葡萄糖相比更適合于愈傷組織的誘導(dǎo)。其最佳的培養(yǎng)方案為添加0 mg/L NH4NO3和3％蔗糖,誘導(dǎo)率可達(dá)到90％以上。然后對預(yù)培養(yǎng)時間、浸染時間、共培養(yǎng)時間等因素對轉(zhuǎn)化的影響進(jìn)行了探討,優(yōu)化了轉(zhuǎn)化條件。結(jié)果表明,預(yù)培養(yǎng)時間、浸染時伺、共培養(yǎng)時間對轉(zhuǎn)化效率有一定的影響,它們

4、在一定范圍內(nèi)與抗性愈傷組織誘導(dǎo)率成正比,這些因素過高或過低都不利于農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化。安祖花葉片轉(zhuǎn)化的最佳預(yù)培養(yǎng)時間為4天,侵染時間為20分鐘,共培養(yǎng)時間為3天,卡那霉素(Km)選擇壓為30 mg/L。產(chǎn)生抗性愈傷組織后將增加至75 mg/L。與根相比,葉片抗性愈傷組織更容易再生出芽,試驗得到了轉(zhuǎn)化GUS報告基因的抗性苗。對4株抗性苗進(jìn)行PCR檢測,結(jié)果有2株為陽性。
　　 2.建立了根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的安祖花根的轉(zhuǎn)化體系。同樣首先提高了

5、根的愈傷組織誘導(dǎo)率。低濃度的NH4NO3有利于根的愈傷組織誘導(dǎo),濃度較高時起抑制作用；蔗糖比葡萄糖更適合于安祖花愈傷組織的誘導(dǎo)。誘導(dǎo)愈傷組織的最佳培養(yǎng)方案為MS培養(yǎng)基(不含NH4NO3)+3％蔗糖,愈傷組織的誘導(dǎo)率達(dá)到90％以上。然后對預(yù)培養(yǎng)時間、浸染時間、共培養(yǎng)時間等條件對抗性愈傷組織誘導(dǎo)率的影響進(jìn)行了探討,優(yōu)化了轉(zhuǎn)化條件。研究發(fā)現(xiàn),預(yù)培養(yǎng)時間、浸染時間和共培養(yǎng)時間對轉(zhuǎn)化效率有一定的影響,它們在一定范圍內(nèi)與抗性愈傷組織誘導(dǎo)率成正比,這

6、些因素過高和過低都不利于農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化。根的轉(zhuǎn)化最佳條件為預(yù)培養(yǎng)5天,侵染15分鐘,共培養(yǎng)5天,Km選擇壓40 mg/L。產(chǎn)生抗性愈傷組織后Km增加至75 mg/L。與葉片抗性愈傷組織誘導(dǎo)率相比,根的抗性愈傷組織誘導(dǎo)率較高,最高達(dá)到34.3％。對5個由根誘導(dǎo)的抗性愈傷組織中的GUS報告基因進(jìn)行PCR檢測。其中有3個顯示為陽性。
　　 3.構(gòu)建了CBF3超表載體,并將CBF3基因轉(zhuǎn)入安祖花。將CBF3基因構(gòu)建于超表pMV載體中,而后