鈉鈣交換體在缺血預(yù)處理產(chǎn)生的心肌保護中的作用及其機制研究.pdf

1、眾所周知，缺血預(yù)處理可以保護心肌，減少缺血再灌注導(dǎo)致的心肌梗死面積，降低心律失常的發(fā)生率。然而其具體的機制仍未完全闡明。有研究發(fā)現(xiàn)，預(yù)處理期間短暫、可逆的胞內(nèi)鈣離子濃度升高與缺血預(yù)處理的保護作用密切相關(guān)。鑒于心肌缺血再灌注初期，通過激活NCX的反向轉(zhuǎn)運模式使[Ca2+]i升高，引起Ca2+超載及由此導(dǎo)致細胞損傷，而缺血預(yù)處理的程序就是多個短暫的缺血再灌注過程，其病理生理條件相似，所以，我們設(shè)想NCX的反向轉(zhuǎn)運模式可能參與缺血預(yù)處理期間[

2、Ca2+]i升高的調(diào)節(jié)，從而產(chǎn)生心肌保護作用。目前國內(nèi)外尚無相關(guān)的研究報道。
　　缺血預(yù)處理的下游保護效應(yīng)分子眾多，但保護線粒體結(jié)構(gòu)和功能的完整是缺血預(yù)處理保護作用機制中的關(guān)鍵，所以，探討激活NCX的反向轉(zhuǎn)運模式觸發(fā)缺血預(yù)處理的保護作用的下游作用機制具有重要的意義。線粒體上的兩種鉀離子通道已經(jīng)證明是缺血預(yù)處理保護作用的關(guān)鍵通道，因此探討NCX引起[Ca2+]i升高是否通過開放這兩種離子通道從而中發(fā)揮了心肌保護作用，并且這兩種離子通

3、道在其作用機制中所扮演的角色，將為我們深入理解心肌缺血預(yù)處理的病理生理過程及其作用機制提供新的思路。
　　目的：
　　1.明確胞外無鈉法對大鼠心室肌細胞Na+/Ca2+交換體轉(zhuǎn)運模式的影響；
　　2.觀察E4031對NCX反向轉(zhuǎn)運模式的影響，并明確其特異性程度；
　　3.在單心肌模型上觀察缺血預(yù)處理期間，激活或阻斷NCX的反向轉(zhuǎn)運模式對預(yù)處理的心肌保護作用的影響；
　　4．在整體心臟模型上觀察NCX的反向轉(zhuǎn)

4、運模式是否觸發(fā)缺血預(yù)處理的保護作用。
　　5．觀察MitoKATP和MitoKCa兩種線粒體鉀通道在激活NCX的藥物預(yù)處理中的作用，并進一步完善IP的作用機制。
　　方法：
　　1．以常規(guī)酶解法分離成年大鼠心肌細胞，選取形態(tài)、功能良好的心室肌細胞進行實驗觀察。應(yīng)用胞外無鈉法（NMDG）檢測并通過Fura-2/AM熒光法記錄[Ca2+]i的變化。
　　2．預(yù)先給予Ryanodine和Thapsigargin孵育10

5、min以阻斷SR功能，分別給予Nifedipine（L-型鈣通道阻斷劑）和Ni2+、KB-R7943（NCX反向轉(zhuǎn)運模式阻斷劑），觀察記錄[Ca2+]i的升高幅度變化。
　　3．給予E4031預(yù)先孵育后，觀察NMDG導(dǎo)致的[Ca2+]i的升高幅度變化，并觀察給予KB-R7943對E4031引起的[Ca2+]i變化的影響。
　　4．單心肌代謝抑制液孵育30min后，給予正常Tyrode液灌洗10min，通過代謝抑制法模擬缺血預(yù)

6、處理的保護作用。此后再給予缺血液8min，正常Tyrode液灌洗10min制造缺血再灌注損傷。分別觀察E4031預(yù)處理能否模擬MIP作用，KB-R7943能否阻斷MIP和E4031的保護作用。
　　5．制備Langendorff離體心臟灌流模型，通過結(jié)扎/松開冠脈左前降支制造缺血/再灌注。通過2次5min的缺血再灌注過程模擬缺血預(yù)處理作用。以心肌梗死面積和缺血及再灌注初期室性心律失常量化做為評定標準。分別給予不同濃度和給藥方式的E

7、4031，觀察其對缺血再灌注導(dǎo)致的心肌梗死的影響。進一步預(yù)先給予KB-R7943，觀察是否阻斷IP或E4031預(yù)處理的保護作用。
　　6．我們在給予E4031前，預(yù)先給予5-HD（MitoKATP的特異性阻斷劑）或Paxilline（MitoKCa的特異性阻斷劑）觀察是否對E4031的保護作用產(chǎn)生影響，另外，在E4031給藥結(jié)束后，給予5-HD或Paxilline，持續(xù)至再灌注后10min，觀察E4031的保護作用是否會被阻斷。同

8、樣，我們預(yù)先給予KB-R7943，以觀察其對Diazoxide（MitoKATP的激動劑）或NS1619（MitoKCa的激動劑）保護作用的影響，以心肌梗死面積和缺血及再灌注初期室性心律失常量化做為評定標準。
　　結(jié)果：
　　1．當灌流液換為NMDG液后1min，[Ca2+]i即開始升高，而且隨著灌流時間的延長，[Ca2+]i升高幅度逐漸增大；將NMDG溶液中Ca2+濃度由1.25升高至1.8mmol/L時，[Ca2+]i升

9、高幅度進一步增大，用正常Tyrode液沖洗后，[Ca2+]i逐漸恢復(fù)，表明胞外無鈉法可以準確反映[Ca2+]i的變化。
　　2．應(yīng)用L-型鈣通道的選擇性阻斷劑Nifedipine后，NMDG溶液引起的[Ca2+]i升高未見明顯改變。而給予Ni2+或KB-R7943，NMDG溶液引起的[Ca2+]i幾乎被完全抑制。所以，NMDG溶液引起的[Ca2+]i升高與NCX的反向轉(zhuǎn)運模式激活密切相關(guān)。
　　3．預(yù)先給予含10μmol/L

10、E4031的正常Tyrode液10min，可以看到，由NMDG溶液引起的[Ca2+]i上升明顯增加，并且使用15μmol/LKB-R7943可以阻斷E4031引起的[Ca2+]i變化。這結(jié)果表明，E4031通過激活或增強NCX的反向轉(zhuǎn)運模式而引起[Ca2+]i升高。
　　4．代謝預(yù)處理的方法可以模擬缺血預(yù)處理，明顯改善缺血再灌注后心肌細胞的收縮功能。而在代謝預(yù)處理前給予KB-R7943，這種保護作用卻明顯被減弱。預(yù)先給予E4031

11、也可以明顯改善心肌細胞缺血再灌注后的收縮功能，而這種保護作用同樣可以被KB-R7943明顯阻斷。
　　5．在離體灌流心臟上，缺血預(yù)處理可以明顯減少I/R導(dǎo)致的心肌梗死面積，并且減少在缺血及再灌注初期10min內(nèi)惡性心律失常的發(fā)生，而KB-R7943可以阻斷這些保護作用。5μmol/LE4031不論是持續(xù)給予10min還是5min間斷給予2次，均可以明顯減少心肌梗死面積，但間斷給予的方式產(chǎn)生的保護作用更加明顯，并且KB-R7943也

12、可以阻斷其作用。但單獨使用KB-R7943卻對I/R的損傷沒有任何影響。
　　6．預(yù)先給予5-HD/Paxilline或在E4031給藥結(jié)束后，給予5-HD/Paxilline的兩種給藥方式均能明顯阻斷E4031的預(yù)處理保護作用，但是Diazoxide/NS1619的藥物預(yù)處理保護作用卻不受預(yù)先給予的KB-R7943的影響。
　　結(jié)論：
　　1．應(yīng)用Fura-2/AM熒光法記錄[Ca2+]i濃度變化,建立了通過胞外無鈉

13、法對心室肌細胞Na+/Ca2+交換體轉(zhuǎn)運模式的研究方法，并運用該方法明確了E4031可以特異性地激活或增加NCX反向轉(zhuǎn)運模式。
　　2．通過在單心肌細胞和整體心臟的研究發(fā)現(xiàn)，NCX的反向轉(zhuǎn)運模式參與了缺血預(yù)處理期間[Ca2+]i升高的調(diào)節(jié)，從而觸發(fā)了IP的心肌保護作用。激活NCX反向轉(zhuǎn)運模式的藥物預(yù)處理可以明顯改善I/R導(dǎo)致的心肌收縮功能下降，減少心肌梗死面積并降低室性心律失常的發(fā)生。
　　3．在IP保護機制中，NCX應(yīng)位于