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1、第一部分單磷酰脂A預(yù)處理對(duì)大鼠缺血再灌注心肌延遲性保護(hù)作用研究 目的:缺血預(yù)處理即是心肌經(jīng)過一次或幾次短暫缺血后,對(duì)隨后較長(zhǎng)時(shí)間缺血損傷的耐受性增加的現(xiàn)象,它分早、晚兩個(gè)時(shí)段。早期時(shí)段從短暫缺血后數(shù)分鐘開始,持續(xù)2-3小時(shí),而延遲階段是在缺血后12-24小時(shí)出現(xiàn),并持續(xù)3-4天。由于缺血預(yù)處理延遲相持續(xù)時(shí)間長(zhǎng),加上臨床相關(guān)的藥劑也可誘導(dǎo)出預(yù)處理延遲相,因而,藥物預(yù)處理延遲相的研究可能更有臨床應(yīng)用前景,成為研究的熱點(diǎn)。本研究在探討
2、藥物單磷酰脂A是否可誘導(dǎo)出延遲性心肌保護(hù)作用的同時(shí),應(yīng)用核轉(zhuǎn)錄因子NF-KB、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、環(huán)氧化酶-2(COX-2)等信息分子的抑制劑來重點(diǎn)探討這三者是否參與這一過程. 方法:健康雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為6組(每組18只):(1)正常對(duì)照組(NC)組:不做任何處理.(2)缺血再灌注組對(duì)照組:由舌靜脈滴入生理鹽水2ml,24h后結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支(LAD),30min后松解,再灌注120min。(3)ML
3、A預(yù)處理(MLA-P)組:于缺血再灌注前24h由舌靜脈滴入MLA(450μ/kg,溶于2ml生理鹽水中),持續(xù)5min,24h后同缺血再灌注組實(shí)驗(yàn)方法。(4)DDTC+MLA組:于MLA應(yīng)用前10min應(yīng)用NF-κB抑制劑DDTC(150mg/kg)使用,腹腔注射,而后重復(fù)MLA-P組。(5)MLA-P+SMT組:先同MLA預(yù)處理組應(yīng)用藥物,再于第2天缺血再灌注前40min應(yīng)用iNOS的抑制劑SMT,分五次靜脈注射,8min一次,每次0
4、.05mg/kg(總量0.25mg/kg),隨后重復(fù)I/R組。(6)MLA-P+NS-398組:先同MLA預(yù)處理組應(yīng)用藥物,再于第2天缺血再灌注前40min應(yīng)用COX-2的抑制劑NS-398(5mg/kg),腹腔注射,隨后重復(fù)I/R組。再灌注結(jié)束時(shí)檢測(cè)各組心功能(LVSP、±dp/dt.max)、心肌梗死范圍,心肌細(xì)胞凋亡率(TUNEL法)。 結(jié)果:與NC組相比,I/R組心功能明顯惡化、心肌梗死明顯擴(kuò)大、心肌細(xì)胞凋亡率明顯增多(
5、分別P<0.01vsNC組)。與I/R組相比,MLA預(yù)處理組心功能明顯改善、心肌梗死范圍明顯減小、心肌細(xì)胞凋亡明顯減少(分別P<0.01vsI/R組)。應(yīng)用DDTC、SMT、NS-398可完全阻斷MLA預(yù)處理的心肌保護(hù)作用,DDTC+MLA組、MLA-P+SMT組、MLA-P+NS-398組三組心功能、心肌梗死范圍、心肌細(xì)胞凋亡率同I/R組無顯著差別(分別P>0.05vsI/R)。 結(jié)論:MLA預(yù)處理誘導(dǎo)出了延遲性心肌保護(hù)作用,
6、可明顯改善預(yù)處理后24h缺血再灌注心臟功能,減小缺血再灌注心肌梗死范圍和細(xì)胞凋亡率。在此過程中,NF-KB、iNOS、COX-2三者可能起著重要作用。 第二部分iNOS、COX-2在單磷酰脂A預(yù)處理延遲相中的作用及相互關(guān)系研究 目的:本部分重點(diǎn)探討MLA預(yù)處理對(duì)大鼠心肌iNOSmRNA、COX-2mRNA表達(dá)、兩者蛋白表達(dá)的影響以及iNOS、COX-2兩者的相互關(guān)系。 方法:選取健康雄性Wistar大鼠
7、36只隨機(jī)分為6組,正常對(duì)照組及MLA預(yù)處理2hr組、6hr組、10hr組、14hr組、24hr組。應(yīng)用RT-PCR方法檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)心肌iNOSmRNA、COX-2mRNA表達(dá)。另選取健康雄性Wistar大鼠72只隨機(jī)分為4組,每組又分兩個(gè)亞組.1.正常對(duì)照組。2.MLA預(yù)處理組。3.MLA-P+SMT組。4.MLA-P+NS-398組。應(yīng)用免疫印跡法及酶聯(lián)免疫(EIA)法檢測(cè)處理后24hr各組iNOS、COX-2蛋白表達(dá),心肌中前列腺
8、素類化合物及一氧化氮的量。 結(jié)果:未預(yù)處理心肌細(xì)胞內(nèi)iNOSmRNA及COX-2mRNA表達(dá)均較少,MLA預(yù)處理后2hr表達(dá)開始增多,6hr表達(dá)明顯增多(兩者分別約為未預(yù)處理心肌表達(dá)量的3.8倍和3倍),10hr表達(dá)開始減少,14hr表達(dá)更少,MLA預(yù)處理后24hr兩者的表達(dá)恢復(fù)到預(yù)處理前水平。免疫印跡及EIA法檢測(cè)發(fā)現(xiàn):MLA預(yù)處理明顯升高預(yù)處理后24hriNOS蛋白、COX-2蛋白表達(dá)(兩者分別約為未預(yù)處理心肌表達(dá)量的3.7
9、倍和3倍),也明顯提高心肌iNOS活性以及心肌NO、PGE2、6-keto-PGF1α水平(P<0.01vsNC),用SMT、NS-398并不影響MLA預(yù)處理后iNOS、COX-2蛋白表達(dá)。應(yīng)用iNOS抑制劑SMT后,明顯抑制了預(yù)處理導(dǎo)致的iNOS活性以及NO、PGE2,6-keto-PGF1α水平的提高(P<0.01vsMLA-P;P>0.05vsNC),而應(yīng)用COX-2抑制劑NS-398,卻不能影響預(yù)處理導(dǎo)致的iNOS活性以及NO量
10、的增加(P>0.05vsMLA-P;P<0.01vsNC),但能明顯抑制PGE2,6-keto-PGF1α量的增加(P<0.01vsMLA-P;P>0.05vsNC)。 結(jié)論:MLA預(yù)處理使得預(yù)處理后心肌中iNOSmRNA及COX-2mRNA表達(dá)迅速增加,預(yù)處理后(缺血再灌注前)兩者蛋白表達(dá)及其活性產(chǎn)物明顯增加。若分別抑制它們活性產(chǎn)物的增加,則MLA預(yù)處理的延遲相保護(hù)作用都會(huì)被取消。說明MLA預(yù)處理正是通過iNOS、COX-2兩
11、種基因的適度表達(dá)和激活而產(chǎn)生了延遲相保護(hù)作用,它們是MLA預(yù)處理過程中的重要保護(hù)物質(zhì)。同時(shí)發(fā)現(xiàn),與預(yù)處理延遲相保護(hù)作用密切相關(guān)的前列腺素類化合物的活性依賴于iNOS的激活,這表明在MLA誘導(dǎo)的預(yù)處理過程中,在生理功能上iNOS居于COX-2的上游。 第三部分核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB在單磷酰脂A預(yù)處理延遲相中的作用及與iNOS、COX-2關(guān)系研究 目的:探討NF-κB是否介導(dǎo)了單磷酰脂A預(yù)處理延遲保護(hù)作用的產(chǎn)生,并了
12、解NF-κB的阻斷劑對(duì)MLA預(yù)處理誘導(dǎo)iNOS、COX-2mRNA表達(dá)及蛋白表達(dá)的影響。 方法:選取健康雄性Wistar大鼠30只隨機(jī)分為5組:正常對(duì)照組、MLA預(yù)處理15min組、30min組、60min組、DDTC+MLA后30min組.應(yīng)用免疫印跡法及EMSA法檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)NF-κB的核轉(zhuǎn)錄及NF-κB活性。另選取健康雄性Wistar大鼠54只隨機(jī)分為三組:正常對(duì)照組(NCn=18)、MLA預(yù)處理(6hr亞組n=6,24h
13、r亞組n=12)、DDTC+MLA(6hr組亞組n=6,24hr亞組n=12)。應(yīng)用RT-PCR方法檢測(cè)正常對(duì)照組及預(yù)處理后6hr心肌iNOSmRNA、COX-2mRNA表達(dá)。應(yīng)用免疫印跡法及酶聯(lián)免疫法(EIA)法檢測(cè)正常對(duì)照組及預(yù)處理后24hriNOS、COX-2蛋白表達(dá),心肌中前列腺素類化合物及一氧化氮的量。 結(jié)果:未預(yù)處理心肌細(xì)胞核內(nèi)P65蛋白水平及NF-κB活性水平都較低,預(yù)處理后15min可檢測(cè)到核內(nèi)P65蛋白水平及N
14、F-κB活性水平增高,在預(yù)處理后30min心肌細(xì)胞核內(nèi)P65蛋白量及NF-κB活性水平明顯增高并達(dá)到高峰(分別為正常組的2.8和4.1倍),預(yù)處理后60min兩者都有所下降(分別為正常組的1.9和2.0倍),120min兩者都基本回到正常組水平,同正常心肌組無明顯差別(P>0.05vsNC)。DDTC+MLA組心肌核內(nèi)由預(yù)處理導(dǎo)致的P65蛋白的增高及NF-κB活性水平的增高均被阻斷,P65蛋白水平及NF-κB活性水平都較低,同正常心肌組
15、無明顯差別(P>0.05,vsNC)。結(jié)果還發(fā)現(xiàn):預(yù)處理后6hriNOSmRNA、COX-2mRNA表達(dá)及24hr兩者蛋白表達(dá)均明顯增多,處理后24hNO、PGs量明顯增加(分別P<0.01,vsNC),而先應(yīng)用NF-κB抑制劑DDTC,兩者mRNA表達(dá),24hr蛋白表達(dá),NO、PGs量都明顯受到抑制(分別P<0.01vsMLA-P,分別P>0.05vsNC)。 結(jié)論:MLA預(yù)處理誘導(dǎo)了核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB快速核傳移和激活,從而
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