DNMT3A基因與肝癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)性的研究.pdf

1、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3A(DNAmethyltransferase3A,DNMT3A)作為重新甲基轉(zhuǎn)移酶在生物個(gè)體發(fā)育過(guò)程中起DNA甲基化修飾作用,并以表觀遺傳的方式調(diào)控基因的表達(dá)。近年來(lái)研究表明,DNMT3A在多種正常組織中呈不同程度的廣泛性低表達(dá),但在多種腫瘤組織中呈異常高表達(dá)模式。我國(guó)肝癌組織中DNMT3A表達(dá)模式及其與肝癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系尚不清楚,對(duì)這一問(wèn)題的探討和研究將有助子揭示肝癌發(fā)生的表觀遺傳學(xué)機(jī)制。
　　 本研究應(yīng)用R

2、eal-time quantitive PCR、免疫組織化學(xué)、Western blot等方法分析了肝癌組織及肝癌細(xì)胞系中DNMT3A的表達(dá)情況及表達(dá)部位,以了解DNMT3 A在肝癌中的表達(dá)模式及其與肝癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性。應(yīng)用RNA干擾(RNAinterfering RNAi)的方法特異性抑制了肝癌細(xì)胞及癌旁細(xì)胞中DNMT3A的表達(dá),分別應(yīng)用Cell Counting Kit-8(CCK)、軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)以及流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測(cè)DNMT

3、3A沉默后對(duì)肝癌細(xì)胞增殖能力、克隆形成能力以及細(xì)胞周期的影響,以了解DNMT3A通過(guò)影響肝癌細(xì)胞的哪些生物學(xué)行為與功能參與肝癌的發(fā)生發(fā)展。應(yīng)用基因芯片高通量分析DNMT3A在肝癌中可能調(diào)控的基因,并以Real-time PCR驗(yàn)證,以PTEN基因?yàn)槟繕?biāo)基因研究DNMT3A對(duì)抑癌基因的調(diào)控機(jī)制,應(yīng)用MSP(Methylated Specific PCR,MSP)和亞硫酸氫鹽測(cè)序(BisulriteSequencing,BGS)的方法檢測(cè)P

4、TEN基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島的甲基化狀態(tài)和甲基化程度,探討DNMT3A調(diào)控腫瘤抑制基因表達(dá)的可能機(jī)制。研究結(jié)果表明:
　　 1.肝癌中DNMT3A在RNA水平存在表達(dá)升高現(xiàn)象,高表達(dá)率為64％。石蠟組織切片免疫組化結(jié)果顯示DNMT3A在癌旁組織和肝癌組織中的表達(dá)部位主要為細(xì)胞漿。
　　 2.與正常肝細(xì)胞系相比,癌旁細(xì)胞系和肝癌細(xì)胞系中DNMT3A的表達(dá)呈不同程度的異常高表達(dá),乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus

5、,HBV)X基因(HBx)的體外轉(zhuǎn)染上調(diào)了癌旁細(xì)胞系QSG-7701中DNMT3A的表達(dá)水平。
　　 3.RNAi抑制了肝癌細(xì)胞SMMC-7721中DNMT3A的表達(dá),影響了肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、抑制了肝癌細(xì)胞克隆形成的能力。
　　 4.基因芯片結(jié)果顯示,DNMT3A表達(dá)抑制導(dǎo)致了153個(gè)基因表達(dá)上調(diào),26個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。通過(guò)生物信息學(xué)軟件分析發(fā)現(xiàn),71%的上調(diào)基因5'端存在CpG島,在此CpG島序列中存在近80種潛在的轉(zhuǎn)錄因

6、子結(jié)合位點(diǎn)。
　　 5.肝癌中PTEN存在表達(dá)降低現(xiàn)象,去甲基化藥物5-雜氮胞苷處理肝癌細(xì)胞系SMMC-7721,發(fā)現(xiàn)PTEN基因表達(dá)上調(diào)。
　　 6.MSP的結(jié)果顯示,DNMT3A表達(dá)抑制后PTEN基因啟動(dòng)子區(qū)的DNA修飾由甲基化狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槲醇谆癄顟B(tài),BGS與MSP一致,顯示DNMT3A表達(dá)抑制使PTEN基因啟動(dòng)子區(qū)6個(gè)CG位點(diǎn)均出現(xiàn)去甲基化現(xiàn)象。
　　 以上研究結(jié)果提示,DNMT3A在肝癌組織及肝癌細(xì)胞系中