血紅素氧合酶-1-一氧化碳系統(tǒng)(HO-1-CO)在新生鼠缺氧缺血性腦損傷中的變化和作用的研究.pdf

1、目的 觀察新生大鼠缺氧缺血性腦損傷(HIBD)后血紅素氧合酶-1(HO-1)基因表達(dá)及其催化產(chǎn)物一氧化碳(CO)濃度的變化，并探討HO-1/CO系統(tǒng)在HIBD發(fā)生機(jī)制中的作用，以期為臨床診斷、治療新生兒缺氧缺血性腦病(HIE)提供新的方法。 方法 1.制備HIBD模型： 1.142只新生7日齡Wistar大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)對(duì)照組(Sham組)、HIBD1、6、12、24、48和72h組，每組6只。假手術(shù)組

2、于手術(shù)恢復(fù)后24h處死。HIBD各組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)處死。 1.248只新生7日齡Wistar大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)對(duì)照組(Sham組)，生理鹽水組(NS組)，血紅素氧合酶抑制劑鋅原卟啉組(Znpp組)和血紅素氧合酶誘導(dǎo)劑氯化血紅素組(Hemin組)，每組12只，24小時(shí)后處死。 1.3將新生大鼠行頸正中切口，分離結(jié)扎左側(cè)頸總動(dòng)脈后給予低氧(8％O2，92％N2)處理2小時(shí)，制成HIBD模型。Znpp組和Hemin組于造模后分別予

3、腹腔注射Znpp和Hemin50mg/kg，NS組給予等量生理鹽水作為對(duì)照。假手術(shù)組只予分離但不結(jié)扎左側(cè)頸總動(dòng)脈，亦不予低氧處理。 2.神經(jīng)行為能力檢查： 分別于手術(shù)前及缺氧后對(duì)每只新生大鼠進(jìn)行翻身能力、夾尾左旋測(cè)試。 3.腦大體形態(tài)觀察：處死時(shí)觀察每只新生大鼠腦組織的大體形態(tài)。 4.HO-1基因表達(dá)、CO濃度、總超氧化物歧化酶(SOD)活力、丙二醛(MDA)含量、腦細(xì)胞凋亡率的測(cè)定：應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PC

4、R法測(cè)定HO-1基因表達(dá)，再取新鮮血應(yīng)用雙波長(zhǎng)定量測(cè)定法檢測(cè)CO濃度變化，應(yīng)用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD，應(yīng)用改良的硫代巴比妥酸法測(cè)定MDA，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合FITC-AnnexinV/PI雙染法測(cè)定腦細(xì)胞凋亡率。 結(jié)果 1.神經(jīng)行為能力檢查術(shù)前90只大鼠翻身能力、夾尾左旋測(cè)定全部正常。術(shù)后Sham組檢查未見(jiàn)異常。經(jīng)歷缺氧缺血的72只大鼠中，30只不能翻身，28只出現(xiàn)夾尾左旋，14只兩種表現(xiàn)均存在。缺氧缺血開(kāi)始10-15

5、min新生鼠表現(xiàn)煩躁不安；20-30min時(shí)全身紫紺或蒼白、呼吸急促，隨后活動(dòng)明顯減少、夾尾尖叫聲減弱、翻身能力降低或消失、部分有肢體抖動(dòng)、驚厥及嗜睡、昏睡、昏迷等意識(shí)障礙；恢復(fù)正常供氧1h后活動(dòng)逐漸增加，4h后神經(jīng)行為異常多消失。 2.腦大體形態(tài)檢查2.1Sham組雙側(cè)大腦半球?qū)ΨQ，無(wú)腫脹和(或)出血；HIBD組大鼠結(jié)扎側(cè)半球腦組織受損，6h可見(jiàn)顏色蒼白，12-24h蒼白、水腫明顯，體積明顯大于對(duì)側(cè)，部分腦表面有點(diǎn)狀出血或腦室

6、積血；72h可看到結(jié)扎側(cè)半球腫脹開(kāi)始減輕，額頂葉仍可見(jiàn)蒼白區(qū)。 2.2NS組結(jié)扎側(cè)半球腦組織蒼白、腫脹，HO抑制劑組腦組織蒼白，腫脹明顯，甚至出現(xiàn)液化壞死，HO誘導(dǎo)劑組腦組織腫脹程度減輕。 3.新生鼠HIBD后腦組織HO-1基因表達(dá)及全血CO濃度變化測(cè)定結(jié)果在Sham組HO-1基因表達(dá)及CO濃度極低，而在HIBD組，1h即見(jiàn)微弱的升高，隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸升高，在12h達(dá)高峰，與其余各時(shí)間點(diǎn)相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01

7、)，之后逐漸下降，72h時(shí)下降接近1h水平，各時(shí)間點(diǎn)水平均比對(duì)照組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，CO濃度變化與HO-1表達(dá)趨勢(shì)一致，兩指標(biāo)間成正相關(guān)(r=0.914，P<0.01)。 4.Sham組、NS組、Znpp組及Hemin組腦組織中SOD活力、MDA含量、腦細(xì)胞凋亡率、HO-1表達(dá)及血中CO濃度變化測(cè)定結(jié)果與Sham組比較，NS組、Znpp組、Hemin組HO-1基因表達(dá)均增強(qiáng)，CO濃度升高(P<0.05)；與N

8、S組比較，Znpp組HO-1基因表達(dá)明顯減少，CO濃度降低(P<0.05)；Hemin組二者均增多(P<0.05)。NS組、Znpp組、Hemin組MDA含量及細(xì)胞凋亡率均高于Sham組(P<0.05)，總SOD活力低于Sham組；與NS組比較，Znpp組MDA含量及細(xì)胞凋亡率明顯增高(P<0.05)，SOD活力進(jìn)一步降低(P<0.05)；Hemin組MDA含量及細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.05)，SOD活力回升(P<0.05)。

9、 結(jié)論 1.新生大鼠HIBD模型制作成功。 2.新生大鼠HIBD后MDA含量增高，總SOD活力降低，證實(shí)存在自由基的損傷；腦細(xì)胞凋亡率升高，證實(shí)存在細(xì)胞凋亡。 3.缺氧缺血后HO-1及其催化產(chǎn)物CO迅速升高，于HIBD后12h達(dá)最高峰，說(shuō)明HO-1/CO系統(tǒng)可能在HIBD發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要的病理生理作用。 4.HO-1/CO系統(tǒng)在HIBD中具有一定的保護(hù)作用，通過(guò)抑制MDA產(chǎn)生，恢復(fù)SOD活力，抑制神經(jīng)