高糖環(huán)境下mTOR在腎小管上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用及機制研究.pdf

1、目的：研究大鼠腎小管上皮細胞中高糖誘導(dǎo)的活性氧(reactive oxygenspecies，ROS)對哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)的激活作用，以及mTOR對腎小管上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymaltransition，EMT)的影響，并探討其可能的分子機制。
　　方法：本實驗主要通過體外培養(yǎng)大鼠腎小管上皮細胞（normal rat kidn

2、eytubular epithelial cell line，NRK-52E）進行研究。培養(yǎng)的細胞分為正常組(normalglucose group，NG組)、高糖組(high glucose group，HG組)、過氧化氫組(H2O2組)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1組（Transforming Growth Factor-β1 group，TGF-β1組），抗氧化劑組(N-acetyl-L-cysteine group，NAC組)、TGF-β

3、1抑制劑組(SB-431542group，SB-431542組)、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol3-kinase，PI3K)抑制劑組(LY-294002 group，LY-294002組)、mTOR抑制劑組(Rapamycin group，Rapamycin組)。分別在培養(yǎng)48 h時檢測以下各項指標:倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化;流式細胞儀檢測細胞中活性氧(Reactive Oxygen Species，R

4、OS)的水平;ELISA法檢測細胞TGF-β1分泌量;Western blotting法測定細胞中蛋白激酶B(protein kinase B,Akt/KB), p-Akt(Ser473), mTOR, p-mTOR(Ser2448),E-鈣粘蛋白(E-cadherin)，α-平滑肌肌動蛋白(α-Smooth Muscle Actin，α-SMA)的蛋白表達水平;Real time RT-PCR法測定TGF-β1 mRNA、E-cadh

5、erin mRNA、α-SMA mRNA的相對含量。
　　結(jié)果：1.細胞形態(tài)變化各組細胞培養(yǎng)48h后，與NG組比較，HG組、TGF-β1組、H2O2組細胞形態(tài)由鋪路石樣轉(zhuǎn)變?yōu)樗笮卫w維樣;與HG組相比，NAC組、LY-294002組、SB-431542組、Rapamycin組細胞形態(tài)較規(guī)則，呈鋪路石樣。
　　2.ROS的變化與NG組比較，HG組在48 h ROS釋放量增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);與HG組相比較，NA

6、C組ROS的生成量減少，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。
　　3.TGF-β1分泌水平及其mRNA的變化與NG組比較，HG組、H2O2組TGF-β1mRNA及蛋白分泌水平顯著提高(P＜0.05或P＜0.01);與HG組比較，NAC組TGF-β1mRNA及分泌量明顯下降(P＜0.05或P＜0.01)。
　　4.Akt蛋白磷酸化水平的變化各組間總Akt(T-Akt)蛋白表達量的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);與NG組比較，

7、HG組、TGF-β1組、H2O2組p-Akt/T-Akt值顯著升高(P＜0.05);與HG組比較，NAC組、LY-294002組、SB-431542組p-Akt/T-Akt值降低(P＜0.05)。
　　5.mTOR蛋白磷酸化水平的變化各組間總mTOR(T-mTOR)蛋白表達量的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）;與NG組比較，HG組、TGF-β1組、H2O2組p-mTOR/T-mTOR值升高(P＜0.01);與HG組比較，NAC組、

8、LY-294002組、SB-431542組、Rapamycin組p-mTOR/T-mTOR值均降低(P＜0.05或＜0.01)。
　　6.E-cadherin、α-SMA表達的差異與NG組比較，HG組、TGF-β1組、H2O2組E-cadherin mRNA水平及其蛋白表達均降低(P＜0.01或P＜0.05)，α-SMA mRNA水平及其蛋白表達均升高，（P＜0.01）;與HG組比較，NAC組、LY-294002組、SB-4315