FMNL3在鼻咽癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：⑴檢測(cè)鼻咽癌組織中formin-like3(FMNL3)蛋白的表達(dá)，分析其與臨床資料參數(shù)及與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）標(biāo)志物上皮性鈣粘附蛋白(E-Cadherin)和波形蛋白(Vimentin)表達(dá)的相關(guān)性。⑵體外檢測(cè)鼻咽癌細(xì)胞系FMNL3、E-Cadherin和Vimentin的mRNA和蛋白表達(dá)水平，同時(shí)利用外源性轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming gr

2、owth factor-β，TGF-β1)誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞EMT，觀察細(xì)胞表型的變化，探討FMNL3在其中發(fā)揮的作用及意義。
　　 方法：①應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)29例鼻咽粘膜慢性炎，103例鼻咽癌組織中E-Cadherin、Vimentin和FMNL3蛋白的表達(dá)水平，分析其相關(guān)性。②應(yīng)用熒光定量PCR、免疫熒光和Western blot方法檢測(cè)人永生化鼻咽上皮細(xì)胞系NP69及3種轉(zhuǎn)移能力不同的鼻咽癌細(xì)胞系(CNE1、CNE2、

3、C666-1)中E-Cadherin、Vimentin和FMNL3的mRNA和蛋白表達(dá)水平。③TGF-β1誘導(dǎo)鼻咽癌CNE2細(xì)胞后，應(yīng)用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力的改變。熒光定量RT-PCR和免疫熒光檢測(cè)FMNL3、E-Cadherin和Vimentin的表達(dá)水平的變化。④熒光定量PCR篩選有效的靶向FMNL3基因的小干擾RNA（siRNA），脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將有效siRNA導(dǎo)入CNE2細(xì)胞中，應(yīng)用熒光定

4、量PCR、免疫熒光和Western blot方法檢測(cè)FMNL3基因沉默前后TGF-β1對(duì)CNE2細(xì)胞E-Cadherin和Vimentin的表達(dá)水平變化。
　　 結(jié)果：⑴在鼻咽癌組織中，Vimentin、FMNL3的表達(dá)明顯高于鼻咽粘膜慢性炎組織，兩者比較差異有顯著性(P＜0.001)，而E-Cadherin的表達(dá)則明顯降低，差異有顯著性(P＜0.001)。FMNL3蛋白表達(dá)與鼻咽癌患者臨床分期（Ⅰ～Ⅱ vs.Ⅲ～Ⅳ，P＜0.0

5、01），T分期（T1-T2 vs.T3-T4 P=0.003），N分期(N0-N1 vs.N2-N3，P=0.024)密切相關(guān)。Vimentin蛋白表達(dá)與患者臨床分期（Ⅰ～Ⅱ vs.Ⅲ～Ⅳ，P=0.001）和T分期（T1-T2 vs.T3-T4，P=0.008）顯著有關(guān);E-Cadherin胞膜表達(dá)水平與臨床分期（Ⅰ～Ⅱ vs.Ⅲ～Ⅳ，P=0.001）、T分期（T1-T2 vs.T3-T4，P=0.011）、N分期(N0-N1 vs.N

6、2-N3，P=0.028)密切相關(guān)。Spearman相關(guān)性分析顯示， FMNL3與E-Cadherin呈負(fù)相關(guān)（r=-0.222，P=0.024），與Vimentin呈正相關(guān)（r=0.269，P=0.006）。以上結(jié)果提示FMNL3與鼻咽癌發(fā)生EMT密切相關(guān)。⑵鼻咽癌細(xì)胞系FMNL、E-Cadherin和Vimentin的表達(dá)分別從蛋白水平和mRNA水平上檢測(cè)人永生化鼻咽粘膜上皮細(xì)胞NP69和不同侵襲轉(zhuǎn)移能力的鼻咽癌細(xì)胞（CNE1、CN

7、E2和C666-1）中FMNL3、E-Cadherin和Vimentin的表達(dá)，結(jié)果顯示:與NP69相比，其他三系鼻咽癌細(xì)胞中的E-Cadherin表達(dá)均明顯下調(diào)（P均＜0.001），Vimentin表達(dá)則上調(diào)（P均＜0.05）;在鼻咽癌細(xì)胞系CNE1、CNE2和C666-1中FMNL3的表達(dá)與Vimentin的表達(dá)相一致均上調(diào)。以上結(jié)果提示FMNL3可能與鼻咽癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，其機(jī)制可能與鼻咽癌細(xì)胞的EMT相關(guān)。⑶外源性TGFβ1(

8、10 ng/ml)刺激CNE2細(xì)胞24小時(shí)后，癌細(xì)胞開始離散，隨著時(shí)間的推移，細(xì)胞間連接更加松散，細(xì)胞形態(tài)由多邊形、圓形逐漸變成紡錘形、長(zhǎng)梭形，120小時(shí)后變成典型的間質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞。劃痕愈合實(shí)驗(yàn)和Transwell小室細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TGFβ1(10 ng/ml)刺激能增強(qiáng)CNE2細(xì)胞的遷移能力。從蛋白和mRNA水平檢測(cè)結(jié)果顯示，TGFβ1處理CNE2細(xì)胞48小時(shí)后，CNE2細(xì)胞的FMNL3和Vimentin均上調(diào)，而E-Cadh

9、erin下調(diào)。以上結(jié)果提示TGFβ1可能具有誘導(dǎo)CNE2細(xì)胞發(fā)生EMT的作用。⑷沉默CNE2細(xì)胞的FMNL3基因后，劃痕愈合實(shí)驗(yàn)和Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CNE2細(xì)胞的遷移能力減弱(P＜0.01)，從蛋白和mRNA水平檢測(cè)結(jié)果顯示，E-Cadherin mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào)（P均＜0.05），Vimentin mRNA和蛋白表達(dá)下調(diào)（P均＜0.05）。與單純沉默組相比，沉默CNE2細(xì)胞的FMNL3基因后，加入外源性TGFβ1

10、(10ng/ml)刺激，劃痕愈合實(shí)驗(yàn)和Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示細(xì)胞的遷移能力提高（P均＜0.05），F(xiàn)MNL3和Vimentin的mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào)（P均＜0.05），E-Cadherin mRNA和蛋白表達(dá)下調(diào)（P均＜0.05）。
　　 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)首次證實(shí)FMNL3在鼻咽癌中高表達(dá);并且與鼻咽癌的臨床生物學(xué)行為進(jìn)展密切相關(guān)，其機(jī)制可能是通過腫瘤細(xì)胞EMT來實(shí)現(xiàn)。FMNL3參與了TGFβ1誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT的