特異性基因改變的人非小細胞肺癌原代動物模型構建及藥物效果評價.pdf

1、第一章人非小細胞肺癌EGFRL858R+V834L基因突變原代動物模型構建與藥物效果評價
　　目的:非小細胞肺癌(non-smallcelllungcancer,NSCLC)是嚴重威脅人類健康的一類癌癥。近年來，靶向藥物治療成為NSCLC治療的重要手段。表皮生長因子受體(epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)是一種酪氨酸激酶(tyrosinekinase，TK)受體，在腫瘤細胞增殖、遷移和分化過程中

2、發(fā)揮重要作用。EGFR在肺癌、乳腺癌等多種腫瘤中過表達，過表達與其基因突變密切相關。EGFR基因突變存在于一部分NSCLC患者，以吉非替尼為代表的EGFR酪氨酸激酶抑制劑對這一部分患者具有良好的治療效果。目前發(fā)現(xiàn)的突變位點多位于EGFR基因外顯子19和21，多數(shù)研究關注單點突變，且多以細胞為研究模型，不能準確模擬在體環(huán)境。本研究首次建立EGFR蛋白L858R+V834L雙突變位點的皮下移植瘤小鼠模型，并觀察吉非替尼在這一模型中的治療效應

3、。
　　方法:腫瘤標本來源于湖南省長沙市中南大學湘雅二醫(yī)院手術患者，女性，54歲，中-低分化腺癌?；蚍中痛_定其EGFRL858R+V834L雙基因突變陽性。原代腫瘤組織被剪成1.0～1.5mm3大小。雌性SCID小鼠背部皮下選取四個點接種瘤塊，每點兩塊，此為第一代荷瘤小鼠(P1)。當某一點的皮下移植瘤直徑大于1cm時，處理小鼠，剝離腫瘤按上述方法接種第二批SCID小鼠(P2)，并重復上述步驟進行腫瘤傳代，建立第三代、第四代荷瘤小

4、鼠。四代小鼠腫瘤組織以EGFR基因突變L858R特異性抗體，采用免疫組織化學法和免疫印跡方法檢測EGFR表達。DNA從腫瘤組織獲得經(jīng)PCR后產(chǎn)物送測序。第三代小鼠接種后，當瘤體直徑達4-5mm時，選取5只小鼠給予吉非替尼治療2周，5只作為溶媒對照，每三天測量腫瘤大小，計算體積，判斷吉非替尼療效。
　　結果:1.成功建立移植瘤模型，P1、P2、P3和P4小鼠移植瘤成功率分別為50％、50％、100％和87.5％。
　　2.免疫

5、組織化學和免疫印跡法確證，各代移植瘤EGFRL858R蛋白表達均呈陽性。
　　3.基因測序顯示，各代移植瘤EGFR基因21外顯子均存在L858R+V834L雙突變位點，確證其與原代腫瘤序列一致。
　　4.吉非替尼治療部分抑制L858R+V834L雙突變移植瘤體的生長。
　　結論:本實驗首次成功構建EGFR基因L858R+V834L雙突變位點的移植瘤小鼠模型，且基因型在傳代過程中保持一致;該模型對吉非替尼治療敏感，可作為

6、NSCLC患者EGFR基因突變陽性靶向藥物篩選的模型。
　　第二章人非小細胞肺癌EML4-ALK融合基因原代動物模型及crizotinib獲得性耐藥模型的構建
　　目的:靶向治療是非小細胞肺癌(NSCLC)的重要治療手段，近年來陸續(xù)發(fā)現(xiàn)多種新的治療靶點。ALK（Anaplasticlymphomakinase，間變性淋巴瘤激酶）融合基因，特別是EML4-ALK融合基因是當前NSCLC靶向治療的新研究熱點。以Crizotini

7、b為代表的ALK抑制劑在臨床應用取得了較好的療效，大多數(shù)ALK融合基因陽性的NSCLC病人對Crizotinib敏感，但最后不可避免地在一年之內因出現(xiàn)耐藥而復發(fā)，部分機制不明，還有患者可有多重耐藥出現(xiàn)，出現(xiàn)另一些激酶的活化如EGFR和其他酪氨酸激酶受體活性的增加，使得耐藥的具體機制更為復雜。已知Akt和ERK等信號通路，特別Akt和ERK磷酸化水平與ALK調控細胞生存與凋亡密切相關，也參與了crizotinib耐藥的發(fā)生。本研究將利用皮

8、下移植瘤技術建立原代非小細胞肺癌EML4-ALK融合基因小鼠，以此為模型，誘導crizotinib獲得性耐藥的發(fā)生，為尋找新型克服Crizotinib抵抗的ALK抑制劑，為臨床ALK融合基因肺癌Crizotinib獲得性耐藥患者的治療提供實驗依據(jù)。
　　方法:腫瘤標本來源于湖南省長沙市中南大學湘雅二醫(yī)院手術患者，男性，40歲，左上肺腺癌，低分化?；蚍中痛_定其EML4-ALK融合基因陽性。原代腫瘤組織被剪成1.0～1.5mm3大小

9、。雌性SCID小鼠背部皮下選取四個點接種瘤塊，每點兩塊，此為第一代荷瘤小鼠(P1)。當某一點的皮下移植瘤直徑大于1cm時，處理小鼠，剝離腫瘤按上述方法接種第二批SCID小鼠(P2)，并重復上述步驟進行腫瘤傳代，建立第三代荷瘤小鼠。三代小鼠腫瘤組織以ALK特異性抗體，采用免疫組織化學法和免疫印跡方法檢測ALK表達。RNA從腫瘤組織獲得經(jīng)RT-PCR后產(chǎn)物送測序。第三代小鼠接種后，當瘤體直徑達8-9mm時，選取6只小鼠給予Crizotini

10、b治療2周，6只作為溶媒對照，每三天測量腫瘤大小，計算體積，判斷crizotinib療效。另有耐藥組10只持續(xù)給藥6個月誘導耐藥形成，提取腫瘤組織蛋白檢測相關蛋白磷酸化水平的變化。
　　結果:1.成功建立移植瘤模型，P1、P2和P3小鼠移植瘤成功率分別為50％、100％、和86.7％。
　　2.免疫組織化學和免疫印跡法確證，各代移植瘤EML4-ALK融合蛋白表達均呈陽性。
　　3.基因測序顯示，各代移植瘤EML4-AL