非小細胞肺癌基因檢測

1、非小細胞肺癌基因檢測腫瘤二科 劉麗珠,前言,隨著分子醫(yī)學進展和靶向藥物的不斷涌現(xiàn)，晚期非小細胞肺癌（NSCLC）的治療已進入到個體化治療的時代。目前臨床應用的個體化靶向治療主要針對EGFR突變型和ALK融合基因型肺癌,這兩種基因變異型肺癌均具有明確的分子靶點、靶點檢測技術及上市的靶向藥物，臨床療效得到明顯提高。,EGFR突變檢測中需要明確的幾個基本概念,2、基因突變是指DNA發(fā)生堿基序列的改變：須選擇有針對性的檢測手段，針對非

2、DNA的檢測手段如：RT-PCR（檢測RNA表達），免疫組化（檢測蛋白表達）以及針對非堿基序列的檢測手段如：FISH（檢測DNA的擴增、缺失、斷裂、融合）等，均不適用。,1、EGFR突變?yōu)轶w細胞突變：發(fā)生于腫瘤細胞中，正常細胞（癌旁或白細胞等）不含突變。要盡可能取到足量的腫瘤細胞進行檢測，這是保證檢測結(jié)果可靠的根本前提。,EGFR基因突變檢測概念,EGFR突變檢測指腫瘤組織中編碼EGFR基因的DNA突變狀態(tài)檢測并不是：EGFR基因D

3、NA拷貝數(shù)的檢測（FISH法）EGFR蛋白表達量的檢測（IHC法）。,X,Nature Review 2007, 7:169,NSCLC中EGFR酪氨酸激酶區(qū)突變種類,標本采集及病理評估,DNA 抽提及質(zhì)控,,,檢測報告,EGFR突變檢測,,ARMS,測序法,,,其它方法,,EGFR 突變檢測流程,EGFR突變檢測中的相關角色,患者,臨床醫(yī)生,,胸外科醫(yī)師,內(nèi)鏡醫(yī)師,收集肺癌組織標本,病理科醫(yī)生,準備樣本,實驗操作及結(jié)果分析,實驗室人

4、員,報告結(jié)果給臨床醫(yī)生,,,,腫瘤科醫(yī)生放療科醫(yī)生呼吸科醫(yī)生,用于EGFR突變檢測的標本,腫瘤組織—目前最可靠的標本；其它樣本： 外周血（血漿、血清） 細胞學 （胸水、痰液細胞學） 支氣管刮取物,,仍需進一步研究確定這些樣本在臨床實踐及診斷中的應用,標本問題,石蠟組織：盡可能送檢一年內(nèi)的石蠟標本。石蠟切片：含腫瘤細胞越多越好（50%以上）；組織部位面積約6mm x 6mm以上；包埋組織：組

5、織塊不小于0.5×0.5×0.5（cm）。 新鮮組織：比石蠟等處理過的舊組織，DNA保存得更完整，對PCR實驗更有利，但一定要經(jīng)病理學確認。含有腫瘤組織50%以上；重量≥10ｍg（約米粒大小以上），經(jīng)PBS或生理鹽水沖洗干凈。取癌組織的中心位置組織塊（避開壞死區(qū)域），固定于10%中性福爾馬林溶液中，盡快送病理科。細胞學標本：可用原發(fā)灶與復發(fā)灶：只要能獲得足夠的癌細胞，均可；但對于復發(fā)的患者，再次活

6、檢不僅可確診，還可以獲得分子標志物的進一步信息。,標本因素對EGFR突變檢測的影響--腫瘤組織特點--,遺傳異質(zhì)性,對檢測方法敏感度有較高要求,標本因素對EGFR突變檢測的影響--組織標本種類--,對檢測方法有相應要求，組織標本及DNA質(zhì)控尤其重要,圖4. EGFR基因檢測使用的臨床樣本及其操作。A.被切成10微米的石蠟包埋標本。B.在支氣管鏡下將刷檢樣本放在生理鹽水中洗凈（懸浮），可以就這樣冷凍保存，C.進一步將該生理鹽水液離心，

7、沉淀溶解于AL緩沖液，此狀態(tài)可以室溫保存。,腫瘤組織標本的采集及病理評估,腫瘤組織標本,病理學評估,組織切片,非小細胞性肺癌診斷及類型腫瘤細胞比例腫瘤細胞總數(shù)標識腫瘤豐富的區(qū)域富集腫瘤細胞,H&E 染色片用于病理評估白片用于提取DNA建議最少切片數(shù)：--手術標本，5 µm X4--小活檢標本，5 µm X8,組織標本來源手術標本支氣管下活檢經(jīng)皮穿刺活檢 標本處理及貯存新鮮凍存：液氮

8、或-80CFFPE,檢測方法,目前 EGFR 基因突變的檢測方法很多DNA 直接測序法應用廣泛，可檢測已知的突變和未知的突變，但對標本的腫瘤細胞含量要求較高，一般要求標本中腫瘤細胞的比例在 50% 以上，至少不低于 30%。基于實時熒光定量 PCR 基礎上的方法（如 ARMS 法）較直接測序法更加敏感，可檢測樣品中 1.0%~0.1% 的突變基因，更適合用于腫瘤細胞含量較少的小標本檢測。ARMS 方法操作簡單，是目前臨床上較常用的

9、方法之一，但只能檢測已知的突變，且標本需進行預處理，檢測費用較高。,直接測序法流程及數(shù)據(jù)分析,PCR**,純化,測序反應,測序儀毛細管電泳,純化,數(shù)據(jù)分析,,,,,,EGFR deletion,EGFR L858R,電泳質(zhì)控,組織標本,DNA,,,**PCR是關鍵：--特異性--產(chǎn)物長度--必要時巢式--建議通用測序引物,,DNA,ARMS反應,,實時定量 PCR,,,ARMS法操作流程及數(shù)據(jù)解讀,數(shù)據(jù)分析,內(nèi)參信號 (HEX)

10、,突變信號: + -內(nèi)參信號: + +,標本 ＃1（突變陽性）,標本 ＃2（突變陰性）,突變信號 (FAM),,,組織標本,,內(nèi)參信號 (HEX),,測序法與ARMS法比較,小結(jié)：,了解你的標本--新鮮/冰凍組織

11、>FFPE組織--手術標本>小活檢標本選擇合適的方法--ARMS是目前較敏感快速方法，且容易開展--測序是傳統(tǒng)的方法，但敏感度有限，過程復雜，不易普及做好組織標本及DNA質(zhì)控是關鍵非腫瘤組織標本的有效利用--在無腫瘤組織情況下，外周血cfDNA、胸水及細針穿刺等細胞學標本均可用于檢測EGFR突變，但其確切的敏感度與特異性尚需進一步探索--必須選擇足夠敏感的方法,EGFR激酶抑制劑的耐藥性,作為臨床上

12、的最大問題，吉非替尼初期有效的全部患者，在后期均產(chǎn)生耐藥。其中50%患者是在缺失或L858R等的敏感性突變的基礎上，又發(fā)生了第790位密碼子蘇氨酸向蛋氨酸的突變（T790M）。在EGFR-TKI治療前很少存在T790M（1～3%22）），這種情況下TKI難以有效。另外50%患者中，其中大約一半患者的耐藥性是由MET基因擴增引起的，EGFR-TKI抗藥性出現(xiàn)時再進行基因檢測，可以選擇與其耐藥機制相對應的治療方法。即在一個患者的各種臨床情

13、況中，掌握EGFR與相關基因的信息，以期進一步改善臨床療效。,EGFR激酶抑制劑耐藥的處理原則,對于緩慢進展的患者，建議繼續(xù)使用原來的 EGFR-TKI 治療或 EGFR-TKI 聯(lián)合化療；對于快速進展的患者，推薦停用 EGFR-TKI，改用化療；于局部進展且原有病灶控制良好的患者，建議繼續(xù)使用 EGFR-TKI 并聯(lián)合局部治療。,EGFR激酶抑制劑耐藥研究進展,第一代EGFR抑制劑Gefitinib (易瑞沙, Iressa)和E

14、rlotinib (特羅凱, Tarceva) 隨著其在臨床上的廣泛應用，耐藥問題日益突出。其中，EGFR-T790M突變約占臨床耐藥病人的60%以上。第二代EGFR抑制劑Afatinib(阿法替尼)。于2013年9月FDA批準上市，于2014年1月在3期臨床研究中以失敗告終。Afatinib在體外對EGFR-T790M突變有活性，但臨床仍然未能克服T790M突變產(chǎn)生的耐藥性。第三代EGFR抑制劑。國外多個制藥公司和研究機構都在開展

15、對T790M突變的小分子抑制劑研究，其中包括克洛維斯腫瘤公司的CO-1686和阿斯利康的AZD9291, 但還沒有針對該突變的藥物上市。,ALK 融合基因是新發(fā)現(xiàn)的 NSCLC 驅(qū)動基因，其中棘皮動物微管相關類蛋白 4（EML4）基因與 ALK（間變性淋巴瘤激酶）的融合（EML4-ALK）為最常見類型。ALK 融合基因主要出現(xiàn)在不吸煙或少吸煙的肺腺癌患者，且通常與 EGFR 基因突變不同時存在于同一患者。NSCLC 患者中 ALK 融

16、合基因的發(fā)生率約為 5%，而在 EGFR、KRAS、HER2 或 TP53 等基因無突變的 NSCLC 患者中，ALK 融合基因陽性率達 25%；我國 EGFR 和 KRAS 均為野生型的腺癌患者中 ALK 融合基因的陽性率高達 30%~42% 。病理形態(tài)學研究提示在含印戒細胞的粘液型或?qū)嵭韵侔┲?，ALK的發(fā)生率高于其他類型的肺腺癌（46.2% vs 8%）ALK陽性的NSCLC雖然僅占全部NSCLC的5%，但是每年新發(fā)病例數(shù)在中國仍

17、接近30,000例,ALK融合基因概念,目前檢測 ALK 融合基因的常用方法主要有熒光原位雜交技術（FISH）、基于 PCR 擴增基礎上的技術和免疫組織化學方法（IHC）。FISH 目前仍是確定 ALK 融合基因的參照標準方法，但價格昂貴，操作規(guī)范要求較高，尚不適用于 ALK 陽性患者的篩查。實時熒光定量 PCR 操作簡便，敏感度高，但需要特定的試劑盒和儀器。IHC 簡便易行、價格便宜、操作方法成熟。VentanaALK 融合蛋白

18、 IHC 診斷試劑盒在不影響特異度的前提下，進一步提高了敏感度，與 FISH 結(jié)果的吻合率達到 98.8%，可重復性達 99.7%，已經(jīng)獲 CFDA 批準用于診斷 ALK 陽性的 NSCLC 患者。,ALK融合基因檢測方法,ALK融合基因陽性有效靶向藥物,針對ALK靶點的小分子抑制劑克唑替尼（Crizotinib）是一種ATP競爭性酪氨酸激酶抑制劑，可特異性靶向抑制ALK激酶，也可抑制c-MET和ROS1等信號通路。臨床試驗顯示對于A

19、LK陽性的晚期NSCLC患者，克唑替尼的療效顯著優(yōu)于傳統(tǒng)化療，二線單藥治療患者的中位PFS為7.7個月，有效率達到65.3% [4]?；谄淞己玫寞熜Ш湍褪苄?，2013年初，中國食品和藥品監(jiān)督管理總局（CFDA）已批準克唑替尼用于治療ALK融合陽性的局部晚期或轉(zhuǎn)移性NSCLC患者常見不良反應（發(fā)生率≥25%）包括視力障礙、惡心、腹瀉、水腫及便秘等,總結(jié),NSCLC 患者治療前應盡量獲取標本，進行 EGFR 基因突變檢測；E