高遷移率族蛋白1在1型糖尿病鼠胰島β細(xì)胞損傷中的作用機(jī)制.pdf

1、1型糖尿病(type1 diabetes mellitus，T1DM)，又稱胰島素依賴型糖尿病或青少年糖尿病，目前普遍的觀點(diǎn)認(rèn)為是免疫學(xué)因素、基因和環(huán)境等因素共同參與了疾病的發(fā)生和發(fā)展的結(jié)果，其主要特點(diǎn)是細(xì)胞介導(dǎo)的胰島β細(xì)胞的損傷。
　　 上世紀(jì)七十年代初發(fā)現(xiàn)的高遷移率族蛋白1(high-mobility group box1，HMGB1)，被認(rèn)為是一種重要的調(diào)控轉(zhuǎn)錄的核蛋白。HMGB1可使DNA彎曲并促使一些調(diào)節(jié)蛋白復(fù)合物同D

2、NA結(jié)合而發(fā)揮作用。此外，HMGB1還參與了許多與炎癥及組織損傷有關(guān)的自身免疫性疾病，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoidarthritis，RA)及系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)。許多重要的受體參與了HMGB1信號(hào)通路，包括toll樣家族受體(toll-like family ofreceptors，TLRs)及晚期糖基化終產(chǎn)物受體(the receptor for advance

3、d glycation endproducts，RAGE)。HMGB1通過(guò)TLRs或RAGE活化核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)發(fā)揮作用，從而誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子的生成、白細(xì)胞粘附分子的上調(diào)、導(dǎo)致組織損傷及炎癥反應(yīng)。
　　 盡管胰島α細(xì)胞圍繞在胰島β細(xì)胞的外周并形成天然的物理屏障，然而在T1DM的發(fā)病過(guò)程中，胰島α細(xì)胞卻幾乎不受影響，而胰島β細(xì)胞則明顯受損。非肥胖糖尿病(non-obese diabet

4、ic，NOD)小鼠可以自發(fā)產(chǎn)生T1DM，且同人類T1DM的發(fā)病特點(diǎn)相似，是國(guó)際公認(rèn)的T1DM模型。HMGB1參與了許多自身免疫性疾病的發(fā)病過(guò)程，T1DM也是一種自身免疫性疾病，然而，HMGB1是否參與了T1DM的發(fā)病過(guò)程及其可能的作用機(jī)制，目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。
　　 本研究用免疫組化技術(shù)檢測(cè)HMGB1在NOD小鼠胰腺中的分布后發(fā)現(xiàn)，在發(fā)病NOD小鼠胞漿中。HMGB1的陽(yáng)性率明顯高于未發(fā)病組，提示HMGB1可能參與了T1DM的發(fā)

5、病過(guò)程。進(jìn)一步檢測(cè)NOD小鼠不同胰島細(xì)胞表面HMGB1受體的分布情況，證實(shí)了HMGB1可以同胰島細(xì)胞表面的TLR4相互作用，且TLR4主要表達(dá)于β細(xì)胞而非α細(xì)胞。接著用基因表達(dá)譜芯片檢測(cè)NOD小鼠糖尿病發(fā)病過(guò)程中的基因變化。最后闡明HMGB1選擇性損傷胰島β細(xì)胞的TLR4信號(hào)通路的作用機(jī)制。
　　 第一部分 NOD小鼠在T1DM發(fā)病過(guò)程中HMGB1的分布和變化特性
　　 目的檢測(cè)HMGB1在NOD小鼠胰腺中的表達(dá)、T1D

6、M發(fā)病過(guò)程中的變化及在胰島細(xì)胞表面其相關(guān)受體的分布。
　　 方法用NOD小鼠建立T1DM模型，每周檢測(cè)血糖變化，蘇木精-伊紅(hematoxylinand eosin，HE)染色觀察發(fā)病過(guò)程中胰島的變化，胰島素染色、激光共聚焦技術(shù)檢測(cè)未發(fā)病NOD小鼠和發(fā)病NOD小鼠胰島免疫熒光染色結(jié)果，并統(tǒng)計(jì)胰島數(shù)目。HMGB1染色并用免疫組化檢測(cè)HMGB1的多少與胰島損傷輕重的關(guān)系。激光共聚焦技術(shù)進(jìn)一步檢測(cè)NOD小鼠胰腺胰島細(xì)胞不同細(xì)胞表面H

7、MGB1受體的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果(1)雌性NOD小鼠最早于4周開(kāi)始發(fā)病，14周～26周發(fā)病明顯增加，至30周的累積發(fā)病率為70％；HE染色鏡下觀察，未發(fā)病NOD小鼠胰腺內(nèi)可見(jiàn)大小不等的胰島細(xì)胞，細(xì)胞呈團(tuán)索狀分布，胰島結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞飽滿，細(xì)胞間有豐富的毛細(xì)血管，胰島內(nèi)未見(jiàn)單核細(xì)胞或淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；發(fā)病小鼠胰島變性、壞死消失，胰島體積變小、萎縮，胰島內(nèi)細(xì)胞數(shù)量較少，纖維組織增生及玻璃樣變；(2)免疫熒光激光共聚焦技術(shù)檢測(cè)：未發(fā)病N

8、OD小鼠胰腺可見(jiàn)胰島β細(xì)胞區(qū)域有大量胰島素陽(yáng)性的紅色熒光，胰島結(jié)構(gòu)完整、細(xì)胞飽滿，紅色熒光區(qū)域較廣，而發(fā)病NOD小鼠胰島β細(xì)胞區(qū)域僅出現(xiàn)少量胰島素陽(yáng)性的紅色熒光，較分散，且分布區(qū)域較??；胰島計(jì)數(shù)：未發(fā)病NOD小鼠胰島數(shù)目較多，發(fā)病的NOD小鼠胰島數(shù)目明顯減少，由42.5±4.90銳減至30.85±9.24，與未發(fā)病組相比有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；(3)HMGB1免疫組化染色結(jié)果顯示：未發(fā)病NOD小鼠胰腺組織HMGBl蛋白主要定

9、位于胞核，發(fā)病NOD小鼠胰島損傷明顯加重，HMGB1蛋白向胞外釋放明顯增多。通過(guò)鏡下計(jì)數(shù)得到HMGB1從胞核向胞漿的轉(zhuǎn)移率發(fā)現(xiàn)，隨著NOD小鼠周齡的增加，T1DM癥狀的加重，胰腺組織中位于胞外的HMGB1明顯增加，HMGB1轉(zhuǎn)移率由19.44±5.08上升到79.22±6.92，組間差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；(4)激光共聚焦技術(shù)檢測(cè)NOD小鼠胰腺組織胰島細(xì)胞表面HMGB1受體，TLR2、TLR4、TLR9和RAGE的免疫熒光

10、表達(dá)情況：4周未發(fā)病NOD小鼠胰腺胰島細(xì)胞表面，幾乎所有的胰島β細(xì)胞膜表面均表達(dá)TLR4，TLR4主要定位在胞膜，呈綠色熒光，而TLR2、TLR9和RAGE的表達(dá)量則很低，甚至完全不表達(dá)；(5)進(jìn)一步檢測(cè)胰島α及β細(xì)胞表面TLR4的表達(dá)情況：分別用胰高血糖素及胰島素標(biāo)記4周未發(fā)病NOD小鼠胰腺的胰島α及β細(xì)胞，采用免疫熒光雙重染色標(biāo)記方法同時(shí)檢測(cè)TLR4在胰島α細(xì)胞及β細(xì)胞上的表達(dá)情況。TLR4主要分布于構(gòu)成胰島主體的β細(xì)胞表面。胰高血

11、糖素陽(yáng)性的胰島α細(xì)胞呈環(huán)狀圍繞在胰島周圍，其表面僅能看到極少量的TLR4陽(yáng)性的細(xì)胞。
　　 結(jié)論隨著1型糖尿病的進(jìn)展，HMGB1表達(dá)量明顯增加，其可能通過(guò)免疫機(jī)制參與了疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程；幾乎所有的胰島細(xì)胞表向均表達(dá)TLR4，而TLR2、TLR9和RAGE的表達(dá)量則很低；胰島β細(xì)胞上HMGB1受體TLR4的表達(dá)較α細(xì)胞多，對(duì)損傷更敏感。
　　 第二部分 NOD小鼠T1DM發(fā)病過(guò)程中的基因變化的芯片測(cè)定
　　 目

12、的基因表達(dá)譜芯片檢測(cè)NOD小鼠糖尿病發(fā)病過(guò)程中的基因變化。
　　 方法經(jīng)膽管穿刺，逆行灌注1.5～2 ml4℃的膠原酶V，分離NOD小鼠的胰腺。將胰腺放入含膠原酶V的D-Hank's平衡液中，并置于37℃恒溫水浴箱中振蕩消化。將消化液用含5％胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的RPMI1640清洗三遍后用Ficoll分離液進(jìn)行純化。分離好的胰島進(jìn)一步用毛細(xì)吸管手工分選，用Dithizone(DTZ)將胰島特

13、異性染為腥紅色進(jìn)行鑒定以保證胰島細(xì)胞的純度；分別提取未發(fā)病及發(fā)病NOD小鼠胰島的總RNA，用NanoDrop ND-1000分光光度計(jì)及標(biāo)準(zhǔn)的變性瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行樣品的質(zhì)量控制；每組取5μg RNA用于標(biāo)記及芯片雜交。將掃描得到的圖像導(dǎo)入NimbleScan軟件(VER2.5)做表達(dá)數(shù)據(jù)等相關(guān)分析。通過(guò)倍比差異法(fold change filtering)分析表達(dá)不同的基因；使用標(biāo)準(zhǔn)富集計(jì)算方法(standard enrichmen

14、t computation method)對(duì)表達(dá)水平不同的基因行基因本體論(gene ontology，GO)分析及信號(hào)通路分析；分層聚類法(Hierarchical clustering)分析兩組基因的表達(dá)差異。
　　 結(jié)果(1)Ficoll法分離后仍有少量胰腺外分泌細(xì)胞和導(dǎo)管細(xì)胞。用毛細(xì)吸管將胰島細(xì)胞手工挑選出來(lái)后，并將純化后的胰島細(xì)胞行DTZ染色，在倒置顯微鏡下觀察：剛分離的胰島，細(xì)胞呈圓形或橢圓形，形態(tài)完整，有折光性。經(jīng)

15、DTZ染色后見(jiàn)約95％的細(xì)胞團(tuán)呈猩紅色，證明分離的胰島純度很高；從電泳圖上可以看到三條清晰的5S、18S、28S核糖體RNA(ribosomal RNA，rRNA)條帶，且28s rRNA的亮度為18s rRNA的兩倍。并且OD260/OD280比值均在1.9～2.0之間，提示總RNA質(zhì)量很好；(2)同Roche NimbleGen公司含44170個(gè)基因的基因組表達(dá)譜芯片雜交，將上述掃描得到的圖像導(dǎo)入NimbleScan軟件(VER2.

16、5)，將原始數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化，剔除掉表達(dá)程度過(guò)低的基因，做表達(dá)數(shù)據(jù)等相關(guān)分析，共得到1007條差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因432條，下調(diào)基因575條；(3)做箱形圖(box plot)比較所有樣品的強(qiáng)度分布，可快速可視化數(shù)據(jù)集的分布；將發(fā)病NOD小鼠組和未發(fā)病NOD小鼠組的芯片雜交圖完全重疊，重疊后的圖像用專業(yè)軟件進(jìn)行分析，得到芯片雜交的散點(diǎn)圖，來(lái)評(píng)估兩組樣品之間基因表達(dá)變化(或重復(fù)性)；(4)GO分析從生物學(xué)過(guò)程、分子功能和亞細(xì)胞組分三個(gè)方面

17、對(duì)基因的功能進(jìn)行分類，每個(gè)大類又可分為下一級(jí)及更下一級(jí)的分支，結(jié)果顯示：在生物學(xué)過(guò)程中，有885(87.7％)個(gè)與代謝相關(guān)的基因上調(diào)；22(18.97％)個(gè)與代謝有關(guān)的基因和21個(gè)(18.10％)與催化活性(regulation of catalytic)相關(guān)的基因下調(diào)；在細(xì)胞組分方面，上調(diào)基因分布比較平均，最高的為細(xì)胞及細(xì)胞成分，占488個(gè)(29.20％)；下調(diào)基因主要為細(xì)胞骨架(cytoskeleton)、微管細(xì)胞骨架(micotu

18、bule cytoskeleton)及相關(guān)組分57個(gè)(78.08％)；上調(diào)的分子功能相關(guān)基因中，有591個(gè)(84.07％)與結(jié)合(binding)有關(guān)。下調(diào)的分子功能相關(guān)基因主要為44個(gè)(30.77％)水解酶活性(hydrolase activity)、17個(gè)(11.89％)酶調(diào)節(jié)活性(enzyme regulatoractivity)；(5)倍比聚集法(fold enrichment)分析后，發(fā)現(xiàn)在生物學(xué)功能中，上調(diào)最明顯的是細(xì)胞核凋

19、亡過(guò)程中形成的DNA碎片(DNA fragmentation)及DNA的分解代謝過(guò)程(DNA catabolic process)，下調(diào)最明顯的是軟骨細(xì)胞的分化調(diào)節(jié)能力；細(xì)胞組分方面，上調(diào)最明顯的是肌球蛋白復(fù)合物(myosin complex)和內(nèi)含體(endosome)，下調(diào)最明顯的是肌球蛋白復(fù)合物Ⅱ和細(xì)胞質(zhì)動(dòng)力蛋白(cytoplasmic dynein complex)；在分子功能中，上調(diào)最明顯的是脫氨酶活性，下調(diào)最明顯的是Rac

20、GTP酶活化活性(Rac GTPaseactivator activity)；(6)Pathway分析NOD小鼠T1DM發(fā)生過(guò)程中明顯上調(diào)的信號(hào)通路為黏蛋白型O聚糖合成信號(hào)通路(mucin type O-Glycan biosynthesis)，基因下調(diào)的信號(hào)通路主要為血管加壓素信號(hào)通路(vasopressin-regulated waterreabsorption)；通過(guò)分析與本課題相關(guān)的基因，發(fā)現(xiàn)TLR4信號(hào)通路中含TIR的接頭蛋白

21、(TIR domain-containing adapter protein，TIRAP)及下游信號(hào)分子被激活。
　　 結(jié)論在T1DM的發(fā)病過(guò)程中，多條信號(hào)通路被激活；通過(guò)分析與本課題相關(guān)的基因，發(fā)現(xiàn)TLR4信號(hào)通路中TIRAP及下游信號(hào)分子被激活。
　　 第三部分
　　 HMGB1選擇性損傷胰島β細(xì)胞的TLR4信號(hào)通路
　　 目的 HMGB1如何同胰島β細(xì)胞的TLR4結(jié)合及其參與損傷胰島β細(xì)胞的機(jī)制。<

22、br>　　 方法分離并純化未發(fā)病NOD小鼠胰島后體外培養(yǎng)；不同劑量HMGB1干預(yù)后用TUNEL法檢測(cè)胰島細(xì)胞的凋亡情況；為進(jìn)一步研究HMGB1同其相對(duì)應(yīng)受體的結(jié)合能力，將胰島細(xì)胞先分別同TLR2、TLR4、TLR9及RAGE抗體預(yù)孵育后再同NHS-Fluorescein標(biāo)記的HMGB1孵育，并用激光共聚焦技術(shù)檢測(cè)其結(jié)合能力；用Western Blotting技術(shù)檢測(cè)NOD小鼠發(fā)病不同時(shí)期胰腺HMGB1及TLR4蛋白的表達(dá)；用實(shí)時(shí)熒光定

23、量PCR技術(shù)對(duì)NOD小鼠糖尿病發(fā)病全程胰腺HMGB1及TLR4 mRNA表達(dá)水平進(jìn)行測(cè)定；通過(guò)ELISA技術(shù)檢測(cè)小鼠外周血血清中炎癥細(xì)胞因子濃度的改變，進(jìn)而了解全身性炎癥反應(yīng)水平的變化情況。
　　 結(jié)果(1)不同濃度HMGB1干預(yù)，TUNEL法檢測(cè)凋亡：高濃度HMGB1(15μg/mE)組胰島細(xì)胞內(nèi)TUNEL陽(yáng)性的胰島細(xì)胞核數(shù)為(20.31±2.36)，較低濃度HMGB1(10μ g/mL)組胰島細(xì)胞內(nèi)TUNEL陽(yáng)性的胰島細(xì)胞核

24、數(shù)(5.56±1.71)及HMGB1(5μ g/mE)組胰島細(xì)胞內(nèi)TUNEL陽(yáng)性的胰島細(xì)胞核數(shù)(2.86±1.36)明顯增加，組間有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，且HMGB1同凋亡數(shù)成正比，表明HMGB1可以促進(jìn)胰島細(xì)胞的凋亡；(2)HMGB1可以與胰島細(xì)胞表面的TLR4特異性結(jié)合：胰島細(xì)胞分別同TLR2、TLR9、RAGE或IgG預(yù)孵育后并不影響胰島細(xì)胞同HMGB1的結(jié)合，然而，同IgG處理過(guò)的對(duì)照組相比，用TLR4抗體及未標(biāo)記HM

25、GB1預(yù)孵育后明顯降低了胰島細(xì)胞同HMGB1的結(jié)合能力。上述結(jié)果提示：HMGB1可以同胰島細(xì)胞表面的TLR4相互作用；(3)用Western Blotting及實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分別從蛋白水平及信使RNA水平檢測(cè)NOD小鼠在自然發(fā)病過(guò)程中HMGB1及TLR4表達(dá)量的變化趨勢(shì)。Western Blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：在未發(fā)病NOD小鼠中HMGB1及TLR4蛋白的表達(dá)量較低，而在發(fā)病早期(10W～14W)其表達(dá)量明顯增加(P<0.01

26、)，在疾病晚期，HMGB1及TLR4蛋白的表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.01)；在NOD小鼠糖尿病的發(fā)病過(guò)程中，每3周～5周檢測(cè)胰腺HMGB1及TLR4 mRNA的表達(dá)變化。分析結(jié)果表明：8周以前的NOD小鼠其胰腺中HMGB1 mRNA的表達(dá)無(wú)明顯變化。然而，在10周時(shí)，胰腺中HMGB1 mRNA的表達(dá)水平顯著升高，上升程度約為4周時(shí)的(8.83～11.59)倍，然后緩慢下降直至接近于8周HMGB1 mRNA的水平。NOD小鼠TLR4 mRNA

27、的表達(dá)同HMGB1mRNA變化趨勢(shì)相近，6周時(shí)NOD小鼠TLR4 mRNA的表達(dá)水平較4周時(shí)明顯升高。然而這一過(guò)程很短暫，在接下來(lái)的8周至10周，TLR4 mRNA的表達(dá)量持續(xù)上升，定量分析提示，第10周時(shí)其表達(dá)水平約為第4周的(14.03～8.58)倍，而后其表達(dá)水平逐漸下降。Western Blotting及實(shí)時(shí)熒光定量PCR數(shù)據(jù)表明：胰島β細(xì)胞表面TLR4的過(guò)表達(dá)同T1DM的進(jìn)展及HMGB1的表達(dá)密切相關(guān)。(4)ELISA結(jié)果提示

28、，與未發(fā)病組相比，發(fā)病組NOD小鼠外周血中白介素(interleukin，IL)-1β(P<0.01)、IL-6(P<0.05)及干擾素(interferon，IFN)-γ(P<0.01)的濃度均出現(xiàn)不同程度的上升。以上數(shù)據(jù)表明，隨著T1DM的進(jìn)展，HMGB1、TLR4的過(guò)表達(dá)、二者結(jié)合后導(dǎo)致TLR4信號(hào)通路的激活，能夠改變?nèi)硇匝装Y細(xì)胞因子的分泌特征，增加促炎細(xì)胞因子的分泌，提高T1DM時(shí)機(jī)體內(nèi)的抗炎水平。
　　 結(jié)論 TLR

29、4是胰島β細(xì)胞表面的主要受體，在T1DM的發(fā)病過(guò)程中，HMGB1可以選擇性地同胰島β細(xì)胞而不是胰島α細(xì)胞結(jié)合，選擇性損傷胰島β細(xì)胞；胰島β細(xì)胞表面TLR4的過(guò)表達(dá)同T1DM的進(jìn)展及HMGB1的表達(dá)密切相關(guān)。TLR4在胰島β細(xì)胞中不僅表達(dá)上調(diào)，而且發(fā)揮著相應(yīng)的功能，激活的TLR4信號(hào)通路可通過(guò)活化IL-1β、IL-6、IFN-γ等下游炎癥因子，引起局部炎癥樣反應(yīng)，達(dá)到選擇性破壞胰島β細(xì)胞并使其功能衰竭，最終導(dǎo)致體內(nèi)胰島素分泌不足，糖尿病癥