高遷移率族蛋白B1誘導(dǎo)急性肺損傷小鼠調(diào)節(jié)性T細(xì)胞免疫反應(yīng)的受體機(jī)制.pdf

1、目的：探討高遷移率族蛋白B1（HMGB1）通過Toll樣受體4（TLR4）介導(dǎo)小鼠急性肺損傷時CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（CD4+CD25+Treg）免疫功能及免疫抑制活性的變化；研究CD4+CD25+Treg與CD4+CD25-T細(xì)胞相互作用的影響。
　　方法：分別給健康清潔級C57BL/10J和C57BL/10Sc[分別為TLR4野生型（TLR4+/+）和敲除型（TLR4-/-）]小鼠氣管內(nèi)注射 HMGB1（20μg/只）

2、為實(shí)驗(yàn)組，同時設(shè)立氣管內(nèi)注射生理鹽水野生型小鼠為對照組；①于造模后飼養(yǎng)48小時眼球取血法法處死小鼠收集血清及肺泡灌洗液（BALF）,光鏡下觀察肺臟病理改變，稱重測定肺臟干濕比；采用免疫磁珠分離脾臟CD4+CD25+Treg和CD4+CD25-T細(xì)胞。②將各組部分CD4+CD25+Treg體外培養(yǎng)24小時后，采用流式細(xì)胞儀檢測CD4+CD25+Treg表達(dá)叉頭翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子（FOXP3）和淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4（CTLA-4）的表達(dá)強(qiáng)度，并

3、且用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法檢測BALF中白細(xì)胞介素-1（IL-1）,腫瘤壞死因子-α（TNF-α）及CD4+CD25+Treg分泌的白細(xì)胞介素-10（IL-10）和轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）的含量。③將各組CD4+CD25+Treg與對照組CD4+CD25-T細(xì)胞按1：1比例共培養(yǎng)，包被CD3單抗和可溶性CD28單抗輔助活化；CCK-8法檢測CD4+CD25+Treg對CD4+CD25-T細(xì)胞增殖的抑制作用。并采用ELIS

4、A法檢測共培養(yǎng)體系中分泌的白細(xì)胞介素-4（IL-4）、IL-2和干擾素-γ（IFN-γ）的含量。結(jié)果：
　　1、與對照組相比，兩實(shí)驗(yàn)組小鼠氣管內(nèi)注射HMGB1后，肺組織損傷程度明顯嚴(yán)重，肺臟干濕比值及BALF灌洗液中TNF-α，IL-1含量顯著增高，且TLR4野生型小鼠較TLR4敲除型小鼠病變程度更加嚴(yán)重；
　　2、流式細(xì)胞學(xué)檢測免疫磁珠分選的CD4+CD25+Treg純度在90％以上；TLR4野生型急性肺損傷小鼠FOXP3

5、和CTLA-4表達(dá)強(qiáng)度低于對照組和TLR4敲除型(P<0.05)；野生型實(shí)驗(yàn)組小鼠Treg分泌的IL-10及TGF-β含量較對照組含量降低（P<0.05），而TLR4敲除型較對照組IL-10及TGF-β含量升高（P<0.05）；
　　3、經(jīng)CD3和CD28輔助活化后，TLR4野生型急性肺損傷小鼠CD4+CD25+Treg與效應(yīng)T細(xì)胞共培養(yǎng)上清中，IL-2，IFN-γ含量高于對照組（P<0.05），IL-4含量低于對照組（P<0.0

6、5），提示CD4+CD25+Treg可使T細(xì)胞極化Th2細(xì)胞能力減弱，向Th1細(xì)胞方向極化；而TLR4敲除型急性肺損傷小鼠CD4+CD25+Treg與效應(yīng)T細(xì)胞共培養(yǎng)上清中，IL-2，IFN-γ含量低于對照組（P<0.05），IL-4含量高于對照組（P<0.05），CD4+CD25+Treg介導(dǎo)的免疫抑制效應(yīng)促使T細(xì)胞極化為Th2細(xì)胞，引起Th1/Th2的漂移。
　　結(jié)論：1、氣管內(nèi)注射HMGB1可以誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷模型；2、免

7、疫磁珠分選的CD4+CD25+Treg細(xì)胞純度較高，可以滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求；3、在急性肺損傷時HMGB1可通過TLR4下調(diào)CD4+CD25+Treg的免疫功能，使CD4+CD25+Treg中Foxp3和CTLA-4分子的表達(dá)下調(diào)，從而減弱其免疫抑制功能的發(fā)揮；4、在急性肺損傷時HMGB1可通過TLR4使CD4+CD25+Treg極化Th2細(xì)胞能力減弱，向Th1細(xì)胞方向極化，弱化了CD4+CD25+Treg的功能，影響炎癥反應(yīng)的結(jié)局；為A