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文檔簡介
1、目的:探討高遷移率族蛋白B1(HMGB1)通過Toll樣受體4(TLR4)介導小鼠急性肺損傷時CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞(CD4+CD25+Treg)免疫功能及免疫抑制活性的變化;研究CD4+CD25+Treg與CD4+CD25-T細胞相互作用的影響。
方法:分別給健康清潔級C57BL/10J和C57BL/10Sc[分別為TLR4野生型(TLR4+/+)和敲除型(TLR4-/-)]小鼠氣管內(nèi)注射 HMGB1(20μg/只)
2、為實驗組,同時設立氣管內(nèi)注射生理鹽水野生型小鼠為對照組;①于造模后飼養(yǎng)48小時眼球取血法法處死小鼠收集血清及肺泡灌洗液(BALF),光鏡下觀察肺臟病理改變,稱重測定肺臟干濕比;采用免疫磁珠分離脾臟CD4+CD25+Treg和CD4+CD25-T細胞。②將各組部分CD4+CD25+Treg體外培養(yǎng)24小時后,采用流式細胞儀檢測CD4+CD25+Treg表達叉頭翼狀螺旋轉錄因子(FOXP3)和淋巴細胞相關抗原4(CTLA-4)的表達強度,并
3、且用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法檢測BALF中白細胞介素-1(IL-1),腫瘤壞死因子-α(TNF-α)及CD4+CD25+Treg分泌的白細胞介素-10(IL-10)和轉化生長因子-β(TGF-β)的含量。③將各組CD4+CD25+Treg與對照組CD4+CD25-T細胞按1:1比例共培養(yǎng),包被CD3單抗和可溶性CD28單抗輔助活化;CCK-8法檢測CD4+CD25+Treg對CD4+CD25-T細胞增殖的抑制作用。并采用ELIS
4、A法檢測共培養(yǎng)體系中分泌的白細胞介素-4(IL-4)、IL-2和干擾素-γ(IFN-γ)的含量。結果:
1、與對照組相比,兩實驗組小鼠氣管內(nèi)注射HMGB1后,肺組織損傷程度明顯嚴重,肺臟干濕比值及BALF灌洗液中TNF-α,IL-1含量顯著增高,且TLR4野生型小鼠較TLR4敲除型小鼠病變程度更加嚴重;
2、流式細胞學檢測免疫磁珠分選的CD4+CD25+Treg純度在90%以上;TLR4野生型急性肺損傷小鼠FOXP3
5、和CTLA-4表達強度低于對照組和TLR4敲除型(P<0.05);野生型實驗組小鼠Treg分泌的IL-10及TGF-β含量較對照組含量降低(P<0.05),而TLR4敲除型較對照組IL-10及TGF-β含量升高(P<0.05);
3、經(jīng)CD3和CD28輔助活化后,TLR4野生型急性肺損傷小鼠CD4+CD25+Treg與效應T細胞共培養(yǎng)上清中,IL-2,IFN-γ含量高于對照組(P<0.05),IL-4含量低于對照組(P<0.0
6、5),提示CD4+CD25+Treg可使T細胞極化Th2細胞能力減弱,向Th1細胞方向極化;而TLR4敲除型急性肺損傷小鼠CD4+CD25+Treg與效應T細胞共培養(yǎng)上清中,IL-2,IFN-γ含量低于對照組(P<0.05),IL-4含量高于對照組(P<0.05),CD4+CD25+Treg介導的免疫抑制效應促使T細胞極化為Th2細胞,引起Th1/Th2的漂移。
結論:1、氣管內(nèi)注射HMGB1可以誘導小鼠急性肺損傷模型;2、免
7、疫磁珠分選的CD4+CD25+Treg細胞純度較高,可以滿足后續(xù)實驗的要求;3、在急性肺損傷時HMGB1可通過TLR4下調(diào)CD4+CD25+Treg的免疫功能,使CD4+CD25+Treg中Foxp3和CTLA-4分子的表達下調(diào),從而減弱其免疫抑制功能的發(fā)揮;4、在急性肺損傷時HMGB1可通過TLR4使CD4+CD25+Treg極化Th2細胞能力減弱,向Th1細胞方向極化,弱化了CD4+CD25+Treg的功能,影響炎癥反應的結局;為A
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