高遷移率族蛋白1在內(nèi)毒素急性肺損傷中性粒細(xì)胞凋亡改變中的作用探討.pdf

1、急性肺損傷(acutelunginjury，ALI)發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。目前認(rèn)為，ALI本質(zhì)上可能是一種肺內(nèi)過(guò)度性、失控性炎癥反應(yīng)，中性粒細(xì)胞(polymorphonucleargranulocytes，PMN)是參與此過(guò)度性炎癥反應(yīng)的重要炎癥細(xì)胞。ALI時(shí)存在肺內(nèi)PMN凋亡延遲現(xiàn)象，后者可能通過(guò)導(dǎo)致PMN產(chǎn)物延遲釋放或直接損傷肺組織，參與ALI的發(fā)生。 高遷移率族蛋白1(highmobilitygroupboxprotein

2、1，HMGB1)最初被描述為一種參與DNA復(fù)制、修復(fù)、轉(zhuǎn)錄作用的DNA結(jié)合蛋白及介導(dǎo)軸突生長(zhǎng)的膜結(jié)合蛋白。新近發(fā)現(xiàn)，HMGB1可能作為內(nèi)毒素血癥的晚期炎癥介質(zhì)發(fā)揮作用。HMGB1從活化的單核細(xì)胞釋放，參與致死效應(yīng)，且可激活下游細(xì)胞因子釋放。作為一種致炎細(xì)胞因子，HMGB1對(duì)健康動(dòng)物有致死效應(yīng)。膿毒癥患者血清HMGB1水平增高，在死亡患者中其水平達(dá)到高峰。HMGB1釋放的延遲動(dòng)力學(xué)顯示針對(duì)該種毒性細(xì)胞因子的靶向處理對(duì)于未來(lái)治療具有潛在意義

3、。大量證據(jù)表明，HMGB1與延遲的內(nèi)毒素致死性有關(guān)。但HMGB1在脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的PMN凋亡延遲及抑制中的作用尚未闡明；HMGB1是否有助于ALI時(shí)細(xì)胞凋亡的改變也鮮有報(bào)道。而且，HMGB1表達(dá)與PMN凋亡間的交互關(guān)系及HMGB1對(duì)凋亡的調(diào)控能力尚屬未知。本研究(1)應(yīng)用大鼠內(nèi)毒素肺損傷模型，動(dòng)態(tài)觀察ALI發(fā)生過(guò)程中HMGB1的變化與PMN凋亡的相互關(guān)系，以揭示HMGB1在內(nèi)毒素ALI時(shí)PMN

4、凋亡改變中的作用；(2)將白人外周血新鮮分離的PMN與不同濃度的HMGB1(10、100、1000ng/ml)37℃共孵育24h后，流式細(xì)胞術(shù)(flowcytometry，F(xiàn)CM)及末端脫氧核糖轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記(terminaldeoxynucleotidyltransferase-mediateddUTPnickendlabeling,TUNEL)法檢測(cè)其凋亡情況，以闡明HMGB1對(duì)PMN凋亡的影響。研究旨在探討HMG

5、B1對(duì)LPS誘導(dǎo)PMN凋亡改變的調(diào)控機(jī)制，擬為進(jìn)一步闡明ALI的發(fā)病機(jī)制及臨床防治ALI提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)與理論基礎(chǔ)。 研究?jī)?nèi)容：1.靜脈注射LPS復(fù)制大鼠內(nèi)毒素ALI模型。2.觀察內(nèi)毒素ALI大鼠外周血及支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolarlavagefluid，BALF)中PMN的凋亡變化。3.逆轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)大鼠ALI模型不同時(shí)相點(diǎn)肺組織HMGB1mRNA表達(dá)。4.檢測(cè)大鼠ALI模型肺泡巨噬細(xì)胞(alve

6、olarmacrophage，AM)的吞噬功能變化。5.分析大鼠ALI模型肺組織HMGB1mRNA表達(dá)與外周血及BALF中PMN凋亡率的相關(guān)性。6.分析大鼠ALI模型AM吞噬功能與肺組織HMGB1mRNA表達(dá)的相關(guān)性。7.觀察HMGB1合成抑制劑正丁酸鈉(sodiumbutyrate，SB)對(duì)大鼠ALI模型PMN凋亡改變、AM吞噬功能、肺組織HMGB1mRNA表達(dá)的干預(yù)效應(yīng)。8.體外不同劑量HMGB1與人PMN共孵育后檢測(cè)PMN凋亡率。

7、 結(jié)果：1.靜脈注射LPS后，大鼠肺組織水腫及炎性病變程度明顯加重，呈現(xiàn)典型的ALI病理改變。HMGB1合成抑制劑SB干預(yù)可減輕肺損傷程度。 2.LPS致傷后6h內(nèi)，大鼠ALI模型PMN凋亡率逐漸下降，2h時(shí)相點(diǎn)由正常對(duì)照的64.82％±9.15％降至43.67％±3.82％(外周血)，2h、6h時(shí)相點(diǎn)降至53.24％±2.67％及15.65％±9.42％(BALF)(由于正常對(duì)照組BALF中以AM為主，幾乎無(wú)PMN，故

8、仍以外周血PMN作為基礎(chǔ)值)；大鼠BALF中PMN凋亡開(kāi)始時(shí)間及無(wú)細(xì)胞存活時(shí)間均延長(zhǎng)，分別由對(duì)照組的(¨.5±2.9)h、(47.2±8.2)h延長(zhǎng)至(18.4±3.5)h、(63.3±2.1)h。同時(shí)肺組織HMGB1mRNA表達(dá)上調(diào)，6h、24h時(shí)相點(diǎn)分別由正常對(duì)照的0.227±0.045上調(diào)至0.521±0.107及0.648±0.120。SB干預(yù)可減弱LPS誘導(dǎo)的PMN凋亡延遲及抑制，下調(diào)肺組織HMGB1mRNA的表達(dá)。

9、3.大鼠內(nèi)毒素ALI模型6h、12h、24h時(shí)相點(diǎn)AM吞噬率分別由正常對(duì)照的(86.5±9.69)％降至(18.94±2.01)％、(12.64±2.01)％及(12.52±2.41)％；凋亡指數(shù)由正常對(duì)照的2.45±0.39降至1.3±0.15、1.34±0.02及1.3±0.41。相關(guān)性分析顯示，AM吞噬功能與肺組織HMGB1mRNA表達(dá)之間呈顯著負(fù)相關(guān)。 4.體外HMGB1(0、10、100、1000ng/ml)與人PMN

10、共培養(yǎng)后行FCM檢測(cè)，PMN凋亡率分別為(40.53±4.12)％、(40.52±2.73)％、(34.89±1.15)％、(18.77±3.02)％，TUNEL陽(yáng)性率分別為(31.42±4.40)％、(31.39±3.80)％、(25.62±2.46)％、(17.98±3.20)％。 結(jié)論：1.本研究成功復(fù)制了大鼠內(nèi)毒素ALI模型。 2.LPS致傷后大鼠肺組織HMGB1mRNA表達(dá)時(shí)相延遲，但其高水平表達(dá)維持較長(zhǎng)時(shí)間；

11、內(nèi)毒素ALI時(shí)存在PMN凋亡抑制、凋亡時(shí)相延遲現(xiàn)象。HMGB1合成抑制劑SB處理可削弱大鼠內(nèi)毒素肺損傷模型PMN凋亡抑制、延遲效應(yīng)，同時(shí)肺組織HMGB1mRNA表達(dá)下調(diào)，提示HMGB1可能參與內(nèi)毒素ALI時(shí)PMN凋亡改變。 3.LPS致傷可明顯削弱大鼠AM吞噬功能。SB干預(yù)可部分消除LPS所致大鼠AM吞噬功能減退。AM吞噬功能與肺組織HMGB1mRNA表達(dá)的相關(guān)性分析表明，HMGB1高表達(dá)可能參與AM吞噬功能改變；AM吞噬功能減