Mfn2-PERK在高遷移率族蛋白B1介導(dǎo)樹突狀細(xì)胞凋亡機(jī)制中的作用研究.pdf

1、膿毒癥是急危重癥醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重大難題，其中免疫細(xì)胞凋亡是膿毒癥免疫功能障礙的重要原因。而在機(jī)體免疫系統(tǒng)中，樹突細(xì)胞(dendritic cell，DC)作為人體最重要的抗原提呈細(xì)胞，是連接天然免疫和獲得性免疫的橋梁，其功能變化在膿毒癥發(fā)生發(fā)展過程中的作用不可替代，DC凋亡在膿毒癥免疫功能障礙發(fā)病機(jī)制中具有重要意義，與膿毒癥預(yù)后密切相關(guān)。高遷移率族蛋白B1(high mobilitygroup box-1 protein，HMGB1)是膿毒

2、癥重要的晚期炎癥介質(zhì)，我們早期研究發(fā)現(xiàn)HMGB1體外刺激對DC免疫功能狀態(tài)具有雙向調(diào)節(jié)作用，但HMGB1介導(dǎo)DC凋亡效應(yīng)及相關(guān)分子機(jī)制尚未明確。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)是真核細(xì)胞重要內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，在一定程度上通過未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)對理化因素、病原體、細(xì)胞因子等刺激應(yīng)激下細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用，幫助細(xì)胞恢復(fù)正常功能。而ERS持續(xù)存在

3、或過強(qiáng)則啟動(dòng)相關(guān)凋亡信號(hào)通路的活化誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。我們前期研究結(jié)果表明，HMGB1作為炎癥介質(zhì)，體外刺激可誘導(dǎo)DC發(fā)生明顯ERS，可能是HMGB1調(diào)控DC免疫功能的重要機(jī)制。ERS是否參與HMGB1介導(dǎo)DC凋亡效應(yīng)尚不明確。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體功能結(jié)構(gòu)上緊密相依，在細(xì)胞的生命活動(dòng)中發(fā)揮重要作用。研究表明，定位于線粒體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)偶聯(lián)(mitochondria-endoplasmic reticulum physicalcoupling,o

4、r mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane(MAM))的多種分子通過影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體之間的交互作用調(diào)節(jié)細(xì)胞功能。線粒體融合蛋白2(Mitofusin2，Mfn2)是目前定位在MAM上相關(guān)蛋白的研究熱點(diǎn)，與細(xì)胞的活化、凋亡等生理病理變化等存在重要聯(lián)系。更有研究報(bào)道Mfn2可與ERS三條關(guān)鍵信號(hào)通路的啟動(dòng)子之一PERK形成直接物理連接，對PERK-eIF2α通路的激活起

5、著重要調(diào)控作用。本文采用分離培養(yǎng)的原代小鼠脾臟DC和小鼠DC細(xì)胞系(DC2.4)來探討Mfn2-PERK在HMGB1介導(dǎo)DC凋亡效應(yīng)及相關(guān)機(jī)制中的作用及意義。
　　研究目的和方法:
　　1.分離培養(yǎng)正常BALB/c雄性小鼠脾臟DC，用不同濃度HMGB1(1，10，100ng/mL)刺激后培養(yǎng)24小時(shí)(h)，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測DC凋亡，Western blotting檢測DC中ERS標(biāo)志分子GRP78表達(dá)水平、PERK表達(dá)活化

6、水平及ERS介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵分子CHOP表達(dá)水平。
　　2.進(jìn)一步應(yīng)用PERK抑制劑GSK2656157和Salubrinal(eIF-2α去磷酸化酶抑制劑)調(diào)控ERS相關(guān)通路關(guān)鍵分子的活性，探究其對HMGB1介導(dǎo)DC凋亡效應(yīng)的影響。
　　3.穩(wěn)定培養(yǎng)可傳代的DC2.4細(xì)胞系，驗(yàn)證HMGB1刺激的凋亡誘導(dǎo)效果及ERS反應(yīng)情況;應(yīng)用共聚焦顯微鏡檢測Mfn2在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的定位。
　　4.應(yīng)用Mfn2過表達(dá)慢病毒載體轉(zhuǎn)染DC

7、2.4，穩(wěn)定表達(dá)后再給予HMGB1刺激(10ng/mL,24h)，觀察細(xì)胞凋亡情況，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測DC凋亡，Westernblotting法檢測培養(yǎng)細(xì)胞ERS相關(guān)因子GRP78、p-PERK/PERK和CHOP，以及Mfn2表達(dá)水平，探討Mfn2對PERK信號(hào)通路活化的調(diào)節(jié)作用以及對DC凋亡的影響。
　　結(jié)果:
　　1.HMGB1刺激后小鼠脾臟DC凋亡增加，HMGB1刺激48h后在不同劑量組小鼠脾臟DC凋亡率較24h時(shí)間

8、點(diǎn)有所增加(P＜0.05)，其中以HMGB1(10ng/ml)刺激組細(xì)胞凋亡率最高(P＜0.01)，但24h和48h差異并不明顯。應(yīng)用HMGB1刺激后ERS相關(guān)蛋白GRP78、PERK、p-PERK和CHOP表達(dá)上調(diào)，其中GRP78表達(dá)隨劑量的增加而增加(P＜0.05)，而PERK、p-PERK和CHOP表達(dá)在10ng/ml刺激組最強(qiáng)(P＜0.01)。
　　2.Salubrinal干預(yù)可抑制HMGB1誘導(dǎo)的小鼠脾臟DC凋亡(P＜0

9、.05)，下調(diào)GRP78、PERK、p-PERK和CHOP表達(dá)水平;而應(yīng)用PERK抑制劑GSK2656157干預(yù)可導(dǎo)致HMGB1作用下DC凋亡水平明顯增加(P＜0.01)。
　　3.HMGB1刺激DC2.4細(xì)胞株凋亡增加，與HMGB1介導(dǎo)DC凋亡效應(yīng)相當(dāng)，在10 ng/ml刺激24h作用明顯。同時(shí)伴隨PERK蛋白表達(dá)上調(diào)、活性增加(P＜0.05)，CHOP表達(dá)升高(P＜0.05)。
　　4.HMGB1刺激導(dǎo)致小鼠脾臟DC內(nèi)M

10、fn2表達(dá)降低，且隨刺激劑量的增加而減少(P＜0.05)，HMGB1刺激下DC2.4細(xì)胞株的Mfn2蛋白表達(dá)亦明顯降低(P＜0.05)。
　　5.LV-Mfn2-GFP慢病毒轉(zhuǎn)染DC2.4細(xì)胞株可提高M(jìn)fn2表達(dá)水平，而細(xì)胞內(nèi)PERK表達(dá)及活化水平均有所降低(P＜0.05)。同時(shí)HMGB1(10ng/ml)刺激下DC2.4細(xì)胞凋亡率明顯下降(P＜0.05); CHOP表達(dá)水平亦降低(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　一