α2-腎上腺素受體激動劑對耳蝸螺旋神經節(jié)細胞的保護作用及機制研究.pdf

1、第一部分α2-腎上腺素受體在大鼠耳蝸的分布表達研究
　　 研究目的:α2-腎上腺素受體(α2-adrenergicreceptors，α2-ARs)是腎上腺素受體(adrenergicreceptor，AR)家族的重要組成部分。盡管一些功能性方面的研究，如藥理學實驗，通過α2-ARs激動劑和拮抗劑間接證實了α2-ARs在耳蝸存在，但形態(tài)學方面直接觀察α2-ARs在耳蝸分布表達狀況的資料目前尚未見報道。了解α2-ARs在耳蝸分布表

2、達特征，是進一步深入研究其在耳蝸發(fā)揮功能的基礎。所以本實驗主要從形態(tài)學角度觀察α2-ARs在初生7天乳大鼠耳蝸的表達分布規(guī)律。
　　 實驗方法:我們通過免疫組織化學染色來檢測α2-ARs的三種亞型:α2a-，α2b-和α2c-AR在初生7天乳大鼠耳蝸的分布表達情況。為保證觀察結果更具普遍性，染色的耳蝸切片至少來源自5只動物。α2a-和α2c-AR是多克隆抗體，α2b-AR是單克隆抗體。陽性對照選擇腎臟組織。我們把在腎臟組織切片染

3、色過程中，摸索出的作用效果較好的一抗?jié)舛龋瑓⒖紤玫蕉伣M織切片的染色中。
　　 實驗結果:我們發(fā)現(xiàn)α2-ARs在耳蝸的表達非常廣泛:包括柯蒂氏器，螺旋神經節(jié)細胞(spiralganglionneurons，SGNs)，螺旋韌帶和血管紋均見α2-ARs三種亞型陽性表達。在柯蒂氏器中，毛細胞，內、外溝細胞和Deiters’細胞等均存在三種亞型的表達，其中，毛細胞的頂部和底部，著色明顯，并且表達強弱無太大差異。我們還發(fā)現(xiàn)，α2-AR

4、s在不同亞型之間的細胞定位不同:α2a-AR主要定位在細胞核和核周部分，α2b-和2c-AR主要定位于細胞膜和核周部分。α2-ARs在耳蝸三轉分布無明顯強弱的變化。
　　 研究結論:α2-ARs在SGNs的表達，提示其可能影響SGNs的發(fā)育或功能。α2-ARs在柯蒂氏器廣泛表達提示柯蒂氏器的支持細胞不僅為毛細胞提供機械支持，同時也可能為毛細胞提供代謝支持。α2-ARs表達在血管紋和螺旋韌帶，提示α2-ARs可能參與調控特殊離子濃

5、度梯度并調節(jié)內淋巴液的產生。α2-ARs在耳蝸的廣泛表達為研究其在耳蝸的功能奠定了基礎，α2-ARs可能在調節(jié)耳蝸功能方面發(fā)揮重要作用。
　　 第二部分溴莫尼定作用于α2-腎上腺素受體保護SGNs對抗谷氨酸和H2O2損傷的機制研究
　　 研究目的:溴莫尼定(brimonidine)，作為高度選擇性α2-腎上腺素受體（α2-adrenergicreceptors，α2-ARs）激動劑，對某些神經細胞具有保護作用。大量實驗結

6、果證實，brimonidine可減輕谷氨酸誘導的神經興奮性毒性，并降低由缺血所致的細胞外升高的谷氨酸濃度;另一方面，brimonidine可完全阻斷活性氧簇的產生，減輕由H2O2誘導的細胞損傷，預防由氧化壓力導致的細胞凋亡。而我們知道，耳蝸螺旋神經節(jié)細胞(spiralganglionneurons，SGNs)的興奮性損傷和氧化損傷是許多類型感音神經性耳聾的基礎。因此，我們假設brimonidine對受損的耳蝸SGNs也有保護作用。這種假

7、設的前提條件是SGNs上有α2-ARs存在。但目前仍不明確SGNs上是否有α2-ARs表達，brimonidine是否對損傷的SGNs有保護作用也未見報道。所以本研究，擬明確α2-ARs在乳大鼠SGNs上的表達情況，并建立谷氨酸和H2O2損傷體外原代培養(yǎng)的SGNs模型，研究brimonidine對谷氨酸和H2O2損傷下的SGNs有無神經保護作用;如果有保護作用，我們將繼續(xù)深入研究brimonidine保護神經的具體機制。這將為感音神經性

8、耳聾提供可能的全新的治療方法。
　　 實驗方法:體外原代培養(yǎng)初生3天乳大鼠SGNs，采用抗-NSE抗體免疫熒光染色法鑒定SGNs后，通過RT-PCR，Westernblot和免疫熒光染色等方法，明確α2-ARs在SGNs上的表達，并定位α2-ARs在SGNs上表達部位。之后建立谷氨酸和H2O2損傷體外原代培養(yǎng)的SGNs模型，進一步觀察在brimonidine干預或不干預的情況下，谷氨酸和H2O2作用于培養(yǎng)的SGNs的變化，通過M

9、TT法分別檢測各組細胞存活率。通過吖啶橙染色和Hoechst33342/PI雙染色法觀察各組細胞的凋亡和壞死情況。通過Westernblot法檢測α2-ARs、Bax、Bcl-2、Caspase-9、Caspase-3、p-ERK1/2、iNOS和artemin的表達變化，從而部分明確brimonidine保護SGNs的具體機制。
　　 實驗結果:SGNs存在α2-ARs三亞型的表達。α2-ARs的mRNA表達的趨勢與其蛋白表達

10、趨勢不平行，并且α2-ARs三亞型在SGNs細胞上的定位是明顯不同的:α2a-受體主要存在于細胞核，細胞內的核周區(qū)域而α2b-和α2c-受體主要定位于核周部分和細胞膜。細胞存活率結果提示:在1mM谷氨酸或300μMH2O2作用下，SGNs細胞存活率明顯降低。當給予谷氨酸干預細胞，培養(yǎng)24小時后，SGNs的細胞存活率相比于對照組降低至76.45±2.76％;當給予H2O2時，細胞存活率較空白對照組降低至62.84±5.16％，即300μM

11、的H2O2所誘發(fā)的SGNs損傷比1mM谷氨酸引起的損傷嚴重。吖啶橙染色和Hoechst33342/PI雙染均發(fā)現(xiàn)給予1mM谷氨酸或300μMH2O2后SGNs均出現(xiàn)明顯的細胞質濃縮，染色質凝聚和凋亡小體等凋亡病理變化。Brimonidine可保護SGNs，減輕谷氨酸或H2O2所致的損傷，明顯提高SGNs細胞存活率:當加入1μM的brimonidine后，谷氨酸組細胞存活率升高到92.97±3.43％(P＜0.001)，H2O2組細胞存活

12、率提高到85.48±5.84％(P＜0.001)，統(tǒng)計學分析有顯著差異。同時，brimonidine可降低由谷氨酸或H2O2誘發(fā)升高的Bax、Caspase-9、Caspase-3、p-ERK1/2和artemin的蛋白表達水平(P＜0.005)，并改變Bcl-2和iNOS的表達(P＜0.005)。上述brimonidine所引起的這些變化和效果均可被育亨賓逆轉(P＜0.05)。
　　 研究結論:我們的研究結果首次描述了α2-A