Beagle犬脂肪干細胞向類髓核細胞分化的實驗研究.pdf

1、現(xiàn)代社會,隨著人口老齡化的不斷增加及生活、工作壓力的不斷加大,越來越多的人出現(xiàn)腰腿痛的癥狀,且具有年輕化的趨勢,研究表明腰椎間盤退行性疾病(degenerative disc disease,DDD)是引起腰腿痛的主要病因之一。DDD不僅嚴重影響了患者的生活質(zhì)量,而且給患者家庭及社會帶來了巨大的醫(yī)療經(jīng)濟負擔。目前多數(shù)學者認為椎間盤的退變源于髓核,髓核細胞凋亡、功能下降,功能性細胞外基質(zhì)合成減少。目前常規(guī)的治療方式都不能從根本上延緩或修復

2、椎間盤的退變,遠期治療效果也不理想。近年來隨著現(xiàn)代醫(yī)學的發(fā)展以及組織工程學技術(shù)的進步,生物學治療技術(shù)成為各領(lǐng)域研究的焦點,其中利用種子細胞移植或組織工程髓核的方法來修復已退變的椎間盤成為新的探索熱點。種子細胞移植治療及細胞活性研究是生物學治療方法研究的基礎(chǔ);組織工程髓核技術(shù)研究的首要問題、基本問題同樣是篩選一種最為合適的種子細胞,然后再聯(lián)合應用生物支架材料、細胞因子等等。截至目前,已研究的種子細胞有很多種,其中脂肪干細胞(adipose

3、 derived stem cells,ADSCs)由于具有取材方便、對機體的創(chuàng)傷小、增殖能力強等諸多優(yōu)點,已經(jīng)廣泛應用于多種組織的再生研究,包括椎間盤退變的修復研究。很多實驗也證實ADSCs的移植可以延緩椎間盤的退變,ADSCs與髓核細胞共培養(yǎng)可誘導ADSCs分化為類髓核細胞,其原理可能就是通過髓核細胞分泌的多種生長因子如轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)等對ADSCs起作用的。目前

4、采用Beagle犬ADSCs在椎間盤退變修復研究中的應用較少,體外聯(lián)合應用兩種細胞生長因子誘導ADSCs分化為類髓核細胞的報道尚少見。
　　基于以往種子細胞移植及組織工程髓核方面的各項研究基礎(chǔ),我們將選取Beagle犬ADSCs作為種子細胞研究對象,聯(lián)合使用TGF-β1、骨形態(tài)發(fā)生蛋白7(bone morphogenetic protein7,BMP-7)兩種生物活性因子作為誘導環(huán)境因素,將細胞接種至該誘導環(huán)境中進行培養(yǎng),研究該誘

5、導液對ADSCs增殖情況的影響,探討B(tài)eagle犬ADSCs向類髓核細胞分化的情況,對ADSCs作為種子細胞移植治療椎間盤退行性疾病的探索和研究提供實驗依據(jù),為髓核組織工程體內(nèi)外實驗研究奠定基礎(chǔ)。
　　目的:觀察體外分離、培養(yǎng)的Beagle犬ADSCs,流式細胞儀檢測細胞免疫表型;研究含有TGF-β1、BMP-7的誘導液對ADSCs增殖及其形態(tài)情況的影響,探討聯(lián)合應用TGFβ-1、BMP-7兩種生長因子能否誘導ADSCs向類髓核細

6、胞分化,證實ADSCs可作為種子細胞,為椎間盤退變的細胞移植治療及組織工程髓核研究提供理論依據(jù)。
　　方法:無菌手術(shù)切取Beagle犬腹股溝處脂肪組織,采用I型膠原酶消化法與細胞貼壁法提取、分離、培養(yǎng)ADSCs,待細胞融合至80％時進行傳代培養(yǎng),倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)特征及生長狀態(tài);細胞計數(shù)法測定第3代ADSCs增殖能力,繪制細胞生長曲線。流式細胞儀檢測第3代細胞表面抗原:CD34、CD45、CD73、CD105、HLA-D

7、R、HLA-ABC。取生物學性能穩(wěn)定細胞進行體外單層誘導培養(yǎng),以細胞密度為1×105/ml接種至普通6孔培養(yǎng)板,分實驗組及對照組,實驗組用含有TGF-β1和BMP-7培養(yǎng)液進行誘導培養(yǎng),對照組采用普通培養(yǎng)液進行培養(yǎng),同時倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài);采用CCK-8法對兩組細胞的增殖能力進行檢測比較;在培養(yǎng)后的第7、14天,提取細胞總RNA,進行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA,利用RealTime-PCR法檢測兩組細胞I型膠原、II型膠原、蛋白多糖的基因相

8、對表達情況。
　　結(jié)果:原代細胞培養(yǎng)第2-3天可見部分細胞貼壁生長,細胞形態(tài)為橢圓形或短梭形,第6-7天觀察細胞開始形成集落,呈典型的長梭形,第10天細胞呈漩渦狀生長,細胞融合率80%左右。第3代ADSCs生長曲線呈“S”型,第1-3天細胞增殖速度較慢,第4-7天細胞呈對數(shù)增殖,第8天后細胞鋪滿平底,生長開始進入平臺期。流式細胞分析檢測細胞免疫表型結(jié)果:ADSCs表達CD73、CD105、HLA-ABC陽性,表達CD34、CD45

9、、HLA-DR陰性。誘導培養(yǎng)7天后,倒置相差顯微鏡觀察見細胞形態(tài)開始變?yōu)槎趟笮巍⒍嘟切?CCK-8法檢測結(jié)果提示在誘導微環(huán)境中培養(yǎng)的細胞增殖速度略低于普通培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細胞的增殖速度。RealTime-PCR檢測結(jié)果顯示,在體外誘導培養(yǎng)第7天,實驗組細胞Ⅱ型膠原和蛋白多糖基因的相對表達量明顯高于對照組(P<0.05),差異具有統(tǒng)計學意義;然而I型膠原基因的相對表達量,兩組之間無明顯差別(P>0.05),無統(tǒng)計學差異;體外誘導培養(yǎng)14天,

10、實驗組細胞II型膠原基因的相對表達量仍高于對照組(P<0.05),但低于誘導培養(yǎng)7天時,此時I型膠原、蛋白多糖基因的相對表達量無統(tǒng)計學差異。
　　結(jié)論:通過I型膠原酶消化法和細胞貼壁分離法能夠成功從Beagle犬腹股溝處脂肪組織中提取分離出ADSCs,其增殖能力強,生物學性能穩(wěn)定;流式細胞儀分析檢測細胞免疫表型提示細胞表達間充質(zhì)干細胞的免疫表型,不表達造血干細胞免疫表型。含有TGF-β1、BMP-7的誘導培養(yǎng)液對ADSCs的增殖有