體外誘導(dǎo)人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島樣細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分、人脂肪來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性觀察
　　 目的：觀察人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(human adipose-derived stem cells，hADMSCs)的形態(tài)學(xué)，生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)及細(xì)胞表面標(biāo)志抗原。
　　 方法：采用酶消化法分離培養(yǎng)脂肪問(wèn)充質(zhì)干細(xì)胞，倒置相差顯微鏡下觀察其生長(zhǎng)和形態(tài)學(xué)變化；流式細(xì)胞技術(shù)分別檢測(cè)細(xì)胞周期和原代、第2代、第4代脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原CD31、CD34、CD44、CD29的表達(dá)。<

2、br>　　 結(jié)果：
　　 1.在脂肪組織中存在能不斷增殖的未成熟細(xì)胞，經(jīng)多次傳代后仍保留很強(qiáng)的增殖能力，倒置相差顯微鏡下觀察呈成纖維細(xì)胞樣。
　　 2.流式細(xì)胞周期檢測(cè)顯示G1期細(xì)胞占絕大多數(shù)，達(dá)到89.055％，S期為10.945％，表明大多數(shù)細(xì)胞處于靜止期，是一群處于未分化狀態(tài)的非定向細(xì)胞。
　　 3.其形態(tài)學(xué)及表面標(biāo)記物與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞類(lèi)似，問(wèn)充質(zhì)干細(xì)胞相關(guān)的表面抗原CD29、CD44隨著傳代表達(dá)水平逐

3、漸增高，與原代細(xì)胞比較沒(méi)有顯著差異(p＞0.05)，內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志CD31陰性表達(dá)。造血干細(xì)胞標(biāo)志CD34隨細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)水平明顯降低，與原代細(xì)胞比較有顯著差異(p＜0.05)。
　　 結(jié)論:通過(guò)酶消化法可從人脂肪組織中獲取間充質(zhì)干細(xì)胞，其與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相似，具有很強(qiáng)的增殖分化能力，通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)到其表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞相關(guān)表面標(biāo)志。
　　 第二部分、體外誘導(dǎo)人脂肪間充質(zhì)千細(xì)胞向胰島樣細(xì)胞的分化
　　

4、目的：體外誘導(dǎo)人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島樣細(xì)胞的分化，探索其誘導(dǎo)條件，為組織工程學(xué)種子細(xì)胞的來(lái)源及其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 方法：酶消化法分離培養(yǎng)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，當(dāng)傳至第4代時(shí)用2-巰基乙醇、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(b-FGF)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)和尼克酰胺誘導(dǎo)其向胰島樣細(xì)胞的分化。人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞分三階段進(jìn)行誘導(dǎo)，第一階段培養(yǎng)在含1mmol/L的2-巰基乙醇的HG-DMEM培養(yǎng)2天，去除舊培養(yǎng)液，用PBS緩沖液沖洗

5、細(xì)胞，第二階段培養(yǎng)在含0.2g/LB27、10μg/L堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)及10μg/L表皮生長(zhǎng)因子(EGF)的HG-DMEM培養(yǎng)基中誘導(dǎo)6天，去除舊培養(yǎng)液，用PBS緩沖液沖洗細(xì)胞，第三階段培養(yǎng)在含1mmol/L2-巰基乙醇、0.2g/L B27和10 mmoL/L尼克酰胺高糖無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)6天誘導(dǎo)細(xì)胞向胰島樣細(xì)胞分化。對(duì)照組用HG-DMEM培養(yǎng)。相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)；RT PCR法檢測(cè)誘導(dǎo)前后nestin

6、、胰島素基因的表達(dá)；免疫熒光染色法檢測(cè)誘導(dǎo)前后nestin、胰島素的表達(dá)；誘導(dǎo)第三階段進(jìn)行雙硫腙染色鑒定胰島β樣細(xì)胞團(tuán)。
　　 結(jié)果：
　　 1、倒置顯微鏡下顯示未經(jīng)誘導(dǎo)的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形貼壁生長(zhǎng)，誘導(dǎo)后細(xì)胞逐漸變圓，并聚集成團(tuán)。
　　 2、熒光顯微鏡下觀察到誘導(dǎo)8天的細(xì)胞nestin蛋白呈陽(yáng)性表達(dá)，誘導(dǎo)14 d細(xì)胞nestin蛋白表達(dá)量下降，胰島素蛋白表達(dá)呈陽(yáng)性。
　　 3、RT PCR法檢測(cè)到

7、誘導(dǎo)8天的nestin mRNA表達(dá)陽(yáng)性，誘導(dǎo)14天的胰島素mRNA表達(dá)陽(yáng)性，nestin mRNA表達(dá)陰性。
　　 4、誘導(dǎo)后的細(xì)胞進(jìn)行雙硫腙染色倒置顯微鏡下觀察誘導(dǎo)后的細(xì)胞呈棕紅色，對(duì)照組細(xì)胞不著色。
　　 結(jié)論：b-FGF、EGF、尼克酰胺等可誘導(dǎo)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞成胰島樣細(xì)胞。
　　 第三部分、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞分化為胰島樣細(xì)胞的功能研究
　　 目的：脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島樣細(xì)胞誘導(dǎo)后，檢測(cè)誘導(dǎo)后細(xì)胞

8、分泌胰島素的功能。
　　 方法：ELIAS檢測(cè)誘導(dǎo)后細(xì)胞對(duì)高糖(50mmol/L葡萄糖)刺激的反應(yīng)及胰島素的分泌，F(xiàn)luo-3/AM染色觀察50mmol/L葡萄糖刺激誘導(dǎo)后細(xì)胞內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度的變化。對(duì)照組為25mmol/L的葡萄糖刺激誘導(dǎo)后細(xì)胞。
　　 結(jié)果：
　　 1、誘導(dǎo)后細(xì)胞經(jīng)50mmol/L葡萄糖刺激后，胰島素的水平明顯增高與對(duì)照組比較有顯著差異(p＜0.05)。
　　 2、誘導(dǎo)后細(xì)胞經(jīng)Flu