低氧下共培養(yǎng)誘導(dǎo)黃韌帶干細(xì)胞向髓核樣細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景：
　　下腰痛是多數(shù)成年人工作缺勤、就醫(yī)、住院治療最普遍的原因，其主要病因是腰椎間盤發(fā)生退變。退變本質(zhì)特征是盤內(nèi)有核細(xì)胞數(shù)量減少和功能降低（細(xì)胞衰老、凋亡）。最先發(fā)生椎間盤退變隨病程進(jìn)展出現(xiàn)腰椎間盤突出、椎管狹窄、甚至癱瘓等神經(jīng)損傷癥狀影響正常生活。目前主要通過藥物、手術(shù)僅限于解除癥狀，在臨床長期的療效上很局限。近年在微創(chuàng)下注射生長因子、基因治療、移植生物材料或干細(xì)胞為基礎(chǔ)的組織工程為求替代髓核并刺激再生成為研究熱點(diǎn)。髓核組織

2、工程為重建退變椎間盤結(jié)構(gòu)和功能提供新的治療方式。健康的、年輕的髓核細(xì)胞是作為種子細(xì)胞的理想選擇，但其體外大量擴(kuò)增困難、物種來源有限阻礙臨床應(yīng)用。干細(xì)胞可以多向分化后可以替代髓核細(xì)胞，而且可以較長時間保持髓核細(xì)胞形態(tài)和表型。人體各個組織中均含有干細(xì)胞如脂肪、上皮、牙髓、骨髓、肌肉、腱、經(jīng)血等，如脂肪中干細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，但大部分種子細(xì)胞存在組織中的含量少且有創(chuàng)、來源有限并不能滿足臨床需要。為此尋找種子細(xì)胞新來源已成為髓核組織工程研究

3、中的“瓶頸”難題之一。我們從黃韌帶組織中分離出來的干細(xì)胞有望成為新的種子細(xì)胞，本實(shí)驗(yàn)對LFSCs（ligamentum flavum stem cells，黃韌帶干細(xì)胞）向NP（nucleus pulposus，髓核細(xì)胞）分化的可行性進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究。
　　篩選出純度較高的LFSCs是實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)，目前多根據(jù)干細(xì)胞表面標(biāo)志物方法使用免疫磁珠篩選、根據(jù)細(xì)胞大小密度梯度離心、多種介質(zhì)包被貼壁粘附法等進(jìn)行初篩上述手段只能去除大部分成熟細(xì)

4、胞而且由于價格昂貴和本身干細(xì)胞缺少特異性標(biāo)記物限制其應(yīng)用。黃韌帶干細(xì)胞高表達(dá)蛋白整合素α5β1和αvβ3，凝血促進(jìn)干細(xì)胞表達(dá)α5β1、αvβ3和纖連蛋白，我們可以利用凝血酶和Fibronectin可以很好的粘附黃韌帶干細(xì)胞而且純度高。基于在黃韌帶干細(xì)胞分離、篩選的基礎(chǔ)上，從形態(tài)變化、免疫表型、CCK8檢測增殖能力、流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期、干性基因、成骨成軟骨成脂肪上探討黃韌帶干細(xì)胞的自我更新和多向分化能力。
　　隨后模擬椎間盤缺氧

5、、3D共培養(yǎng)模式下，檢測誘導(dǎo)分化后黃韌帶干細(xì)胞表達(dá)髓核特異性基因和蛋白表達(dá)以評價其可行性。眾所周知Notch通路在控制分化中占有重要作用，Notch通路下游分子Twist-1控制干細(xì)胞向軟骨系分化，而缺氧控制Notch通路在分化問題上仍有爭議。研究黃韌帶干細(xì)胞在低氧下是否能向髓核分化需對其機(jī)制進(jìn)一步了解，目前HIF-1α調(diào)節(jié)Twist-1是否在黃韌帶干細(xì)胞向髓核分化中發(fā)揮重要作用，尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。我們從干細(xì)胞分化表面標(biāo)志物和特性蛋白發(fā)生

6、改變證明了LFSCs可以向NP-like方向分化。通過構(gòu)建Lentivirus-HIF-1α過表達(dá)載體觀察對Twist1表達(dá)的影響初步證明其抑制關(guān)系，對缺氧因素在向髓核樣（軟骨系）分化中的作用進(jìn)行了探討，以期為髓核組織工程中新的種子細(xì)胞來源及其定向分化提供理論基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.干細(xì)胞篩選方法:從微創(chuàng)手術(shù)中獲得人LF，通過機(jī)械-酶消化-組織貼壁法聯(lián)合獲取原代細(xì)胞后，接種于4 U/ml凝血酶聯(lián)合8μg/cm2Fibro

7、nectin、8μg/cm2Fibronectin、4U/ml凝血酶和BSA包被過的培養(yǎng)瓶，OD值代表粘附率，流式比較篩選百分比。
　　2.自我更新和多能性檢測:對干細(xì)胞表型、表達(dá)相關(guān)特異性蛋白、多向分化能力進(jìn)行檢測。從細(xì)胞周期、增殖能力和干性基因表達(dá)與BM-MSCs進(jìn)行差異比較了解其特征。
　　3.誘導(dǎo)LFSCs向NP-like細(xì)胞分化:模擬低氧環(huán)境和3D培養(yǎng)方法，分低氧和常氧組并分別與髓核細(xì)胞(NPCs)等比例貼附于tr

8、answell嵌套系統(tǒng)1μ m膜的上下面進(jìn)行接觸式共培養(yǎng)，對照組為20％O2培養(yǎng)的黃韌帶干細(xì)胞。RT-PCR檢測共培養(yǎng)第14天髓核特異性表達(dá)基因Sox-9，collagen-Ⅱ，aggrecan，KRT19，CA12，F(xiàn)OXF1，HIF-1α。蛋白質(zhì)印跡法測試aggrecan，collagen-Ⅱ， Hif-1α和SOX9。流式細(xì)胞儀檢測低氧下共培養(yǎng)黃韌帶干細(xì)胞0天，14天，21天分化表型變化及免疫組化染色檢測collagen-Ⅰ、co

9、llagen-Ⅱ、aggrecan表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1.黃韌帶干細(xì)胞高表達(dá)α5β1和αvβ3，使用8μg/cm2Fibronectin和4 U/ml凝血酶包被培養(yǎng)瓶篩選黃韌帶干細(xì)胞篩選后細(xì)胞呈均一長梭形，粘附率OD值明顯高于對照組(P＜0.05)，篩選純度高。
　　2.LFSCs表面標(biāo)志物CD105+，CD44+，CD73+，CD90+和CD29+。CD45-，CD34-，CD133-， stro-1-。三系

10、分化:Alizarin Red陽性，Oil red O染色可見紅色脂滴形成，Alcian Blue染色可見大量細(xì)胞外基質(zhì)AGG呈陽性表現(xiàn)。表達(dá)骨標(biāo)志物:OC、ALP、RUNX-2，脂肪標(biāo)志物:LPL、APP、PPAR2，軟骨標(biāo)志物:COLⅡ、AGG、SOX9顯著上調(diào)，其中RUNX-2在未誘導(dǎo)組有低水平表達(dá)。免疫組化比較LFSCs和BM-MSCs均表達(dá)α-SMA、CollⅠ、fibronectin，都不表達(dá)CollⅡ。與BM-MSCs比較

11、有相似增殖能力。細(xì)胞周期分析LFSCs和BMSCs處于G0/G1期比例均超過80％。NONAG、SOX2在LFSCs和BM-MSCs之間表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，而OCT-4在LFSCs中表達(dá)水平明顯高于BM-MSC(P＜0.05)。
　　3.經(jīng)過14天接觸性共培養(yǎng)后，RT-PCR檢測分化后黃韌帶干細(xì)胞表達(dá)髓核特異性標(biāo)志物KRT19，CA12，ACAN，COL2A1，Sox-9，HIF-1α低氧組均明顯高于常氧組(P＜0.

12、05)，而FOXF1在2％O2和20％O2之間無明顯差異(P＞0.05)。Western-blot檢測蛋白COLⅡ、AGG、SOX9、HIF-1α與基因水平一致，其中HIF-1α在對照組也有低水平表達(dá)。
　　4.微球軟骨誘導(dǎo)小球在第3天和第7天時，過表達(dá)HIF-1α組阿利新蘭染色較未轉(zhuǎn)染組染色深。Realtime-PCR過表達(dá)HIF-1α抑制Notch通路中Twist1的表達(dá)，促進(jìn)Ⅱ型膠原和蛋白聚糖的表達(dá)(P＜0.05)。瞬時轉(zhuǎn)染

13、48小時Twist1熒光染色顯示轉(zhuǎn)染組熒光明顯減弱，蛋白定量6小時、24小時、48小時Twist1表達(dá)量逐漸下降(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.本研究通過對微創(chuàng)手術(shù)取下的黃韌帶組織中含有的干細(xì)胞進(jìn)行篩選方法的研究并對干細(xì)胞進(jìn)行了鑒定，確立了4 U/ml凝血酶聯(lián)合8μg/cm2 fibronectin粘附法，該方法可顯著提高LFSCs的粘附率，以利于LFSCs的分離與篩選。并發(fā)現(xiàn)了LFSCs表達(dá)Stro-1為陰性，與B

14、M-MSCs相比OCT-4表達(dá)水平高。證明了LFSCs具備自我更新和多向分化潛能的特征。
　　2.基于模擬體內(nèi)椎間盤低氧和共培養(yǎng)方式誘導(dǎo)LFSCs向NP-like分化，為探討LFSCs作為髓核組織工程種子細(xì)胞的可行性?，F(xiàn)總結(jié)如下:
　　1)在低氧下LFSCs與NP共培養(yǎng)，我們根據(jù)目前研究鑒定向髓核分化比較有特異性的標(biāo)志物，從形態(tài)、表型變化、基因和蛋白表達(dá)水平驗(yàn)證了黃韌帶干細(xì)胞在低氧情況下更有利于向髓核分化，有望成為組織工程種

15、子細(xì)胞。
　　2)本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究了低氧下黃韌帶干細(xì)胞表達(dá)HIF-1α抑制Notch通路下游基因Twist1的表達(dá)，Twist1的作用抑制軟骨系分化，故HIF-1α相當(dāng)于促進(jìn)了向軟骨系分化的進(jìn)程，但調(diào)控具體機(jī)制還需進(jìn)一步長時間體內(nèi)證實(shí)。
　　3)我們應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)從干細(xì)胞分化過程的表型變化入手，鑒定了分化表型的變化。提示在體外分化成某一階段有特定表型，如分化成髓核的祖細(xì)胞或前體細(xì)胞，既可以維持定向分化又可以降低成瘤的風(fēng)險。