低氧下共培養(yǎng)誘導黃韌帶干細胞向髓核樣細胞分化的實驗研究.pdf

1、背景：
　　下腰痛是多數(shù)成年人工作缺勤、就醫(yī)、住院治療最普遍的原因，其主要病因是腰椎間盤發(fā)生退變。退變本質特征是盤內有核細胞數(shù)量減少和功能降低（細胞衰老、凋亡）。最先發(fā)生椎間盤退變隨病程進展出現(xiàn)腰椎間盤突出、椎管狹窄、甚至癱瘓等神經損傷癥狀影響正常生活。目前主要通過藥物、手術僅限于解除癥狀，在臨床長期的療效上很局限。近年在微創(chuàng)下注射生長因子、基因治療、移植生物材料或干細胞為基礎的組織工程為求替代髓核并刺激再生成為研究熱點。髓核組織

2、工程為重建退變椎間盤結構和功能提供新的治療方式。健康的、年輕的髓核細胞是作為種子細胞的理想選擇，但其體外大量擴增困難、物種來源有限阻礙臨床應用。干細胞可以多向分化后可以替代髓核細胞，而且可以較長時間保持髓核細胞形態(tài)和表型。人體各個組織中均含有干細胞如脂肪、上皮、牙髓、骨髓、肌肉、腱、經血等，如脂肪中干細胞和骨髓間充質干細胞，但大部分種子細胞存在組織中的含量少且有創(chuàng)、來源有限并不能滿足臨床需要。為此尋找種子細胞新來源已成為髓核組織工程研究

3、中的“瓶頸”難題之一。我們從黃韌帶組織中分離出來的干細胞有望成為新的種子細胞，本實驗對LFSCs（ligamentum flavum stem cells，黃韌帶干細胞）向NP（nucleus pulposus，髓核細胞）分化的可行性進行了實驗研究。
　　篩選出純度較高的LFSCs是實驗研究的基礎，目前多根據干細胞表面標志物方法使用免疫磁珠篩選、根據細胞大小密度梯度離心、多種介質包被貼壁粘附法等進行初篩上述手段只能去除大部分成熟細

4、胞而且由于價格昂貴和本身干細胞缺少特異性標記物限制其應用。黃韌帶干細胞高表達蛋白整合素α5β1和αvβ3，凝血促進干細胞表達α5β1、αvβ3和纖連蛋白，我們可以利用凝血酶和Fibronectin可以很好的粘附黃韌帶干細胞而且純度高?；谠邳S韌帶干細胞分離、篩選的基礎上，從形態(tài)變化、免疫表型、CCK8檢測增殖能力、流式細胞儀分析細胞周期、干性基因、成骨成軟骨成脂肪上探討黃韌帶干細胞的自我更新和多向分化能力。
　　隨后模擬椎間盤缺氧

5、、3D共培養(yǎng)模式下，檢測誘導分化后黃韌帶干細胞表達髓核特異性基因和蛋白表達以評價其可行性。眾所周知Notch通路在控制分化中占有重要作用，Notch通路下游分子Twist-1控制干細胞向軟骨系分化，而缺氧控制Notch通路在分化問題上仍有爭議。研究黃韌帶干細胞在低氧下是否能向髓核分化需對其機制進一步了解，目前HIF-1α調節(jié)Twist-1是否在黃韌帶干細胞向髓核分化中發(fā)揮重要作用，尚未見文獻報道。我們從干細胞分化表面標志物和特性蛋白發(fā)生

6、改變證明了LFSCs可以向NP-like方向分化。通過構建Lentivirus-HIF-1α過表達載體觀察對Twist1表達的影響初步證明其抑制關系，對缺氧因素在向髓核樣（軟骨系）分化中的作用進行了探討，以期為髓核組織工程中新的種子細胞來源及其定向分化提供理論基礎。
　　方法:
　　1.干細胞篩選方法:從微創(chuàng)手術中獲得人LF，通過機械-酶消化-組織貼壁法聯(lián)合獲取原代細胞后，接種于4 U/ml凝血酶聯(lián)合8μg/cm2Fibro

7、nectin、8μg/cm2Fibronectin、4U/ml凝血酶和BSA包被過的培養(yǎng)瓶，OD值代表粘附率，流式比較篩選百分比。
　　2.自我更新和多能性檢測:對干細胞表型、表達相關特異性蛋白、多向分化能力進行檢測。從細胞周期、增殖能力和干性基因表達與BM-MSCs進行差異比較了解其特征。
　　3.誘導LFSCs向NP-like細胞分化:模擬低氧環(huán)境和3D培養(yǎng)方法，分低氧和常氧組并分別與髓核細胞(NPCs)等比例貼附于tr

8、answell嵌套系統(tǒng)1μ m膜的上下面進行接觸式共培養(yǎng)，對照組為20％O2培養(yǎng)的黃韌帶干細胞。RT-PCR檢測共培養(yǎng)第14天髓核特異性表達基因Sox-9，collagen-Ⅱ，aggrecan，KRT19，CA12，F(xiàn)OXF1，HIF-1α。蛋白質印跡法測試aggrecan，collagen-Ⅱ， Hif-1α和SOX9。流式細胞儀檢測低氧下共培養(yǎng)黃韌帶干細胞0天，14天，21天分化表型變化及免疫組化染色檢測collagen-Ⅰ、co

9、llagen-Ⅱ、aggrecan表達情況。
　　結果:
　　1.黃韌帶干細胞高表達α5β1和αvβ3，使用8μg/cm2Fibronectin和4 U/ml凝血酶包被培養(yǎng)瓶篩選黃韌帶干細胞篩選后細胞呈均一長梭形，粘附率OD值明顯高于對照組(P＜0.05)，篩選純度高。
　　2.LFSCs表面標志物CD105+，CD44+，CD73+，CD90+和CD29+。CD45-，CD34-，CD133-， stro-1-。三系

10、分化:Alizarin Red陽性，Oil red O染色可見紅色脂滴形成，Alcian Blue染色可見大量細胞外基質AGG呈陽性表現(xiàn)。表達骨標志物:OC、ALP、RUNX-2，脂肪標志物:LPL、APP、PPAR2，軟骨標志物:COLⅡ、AGG、SOX9顯著上調，其中RUNX-2在未誘導組有低水平表達。免疫組化比較LFSCs和BM-MSCs均表達α-SMA、CollⅠ、fibronectin，都不表達CollⅡ。與BM-MSCs比較

11、有相似增殖能力。細胞周期分析LFSCs和BMSCs處于G0/G1期比例均超過80％。NONAG、SOX2在LFSCs和BM-MSCs之間表達無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，而OCT-4在LFSCs中表達水平明顯高于BM-MSC(P＜0.05)。
　　3.經過14天接觸性共培養(yǎng)后，RT-PCR檢測分化后黃韌帶干細胞表達髓核特異性標志物KRT19，CA12，ACAN，COL2A1，Sox-9，HIF-1α低氧組均明顯高于常氧組(P＜0.

12、05)，而FOXF1在2％O2和20％O2之間無明顯差異(P＞0.05)。Western-blot檢測蛋白COLⅡ、AGG、SOX9、HIF-1α與基因水平一致，其中HIF-1α在對照組也有低水平表達。
　　4.微球軟骨誘導小球在第3天和第7天時，過表達HIF-1α組阿利新蘭染色較未轉染組染色深。Realtime-PCR過表達HIF-1α抑制Notch通路中Twist1的表達，促進Ⅱ型膠原和蛋白聚糖的表達(P＜0.05)。瞬時轉染

13、48小時Twist1熒光染色顯示轉染組熒光明顯減弱，蛋白定量6小時、24小時、48小時Twist1表達量逐漸下降(P＜0.05)。
　　結論:
　　1.本研究通過對微創(chuàng)手術取下的黃韌帶組織中含有的干細胞進行篩選方法的研究并對干細胞進行了鑒定，確立了4 U/ml凝血酶聯(lián)合8μg/cm2 fibronectin粘附法，該方法可顯著提高LFSCs的粘附率，以利于LFSCs的分離與篩選。并發(fā)現(xiàn)了LFSCs表達Stro-1為陰性，與B

14、M-MSCs相比OCT-4表達水平高。證明了LFSCs具備自我更新和多向分化潛能的特征。
　　2.基于模擬體內椎間盤低氧和共培養(yǎng)方式誘導LFSCs向NP-like分化，為探討LFSCs作為髓核組織工程種子細胞的可行性?，F(xiàn)總結如下:
　　1)在低氧下LFSCs與NP共培養(yǎng)，我們根據目前研究鑒定向髓核分化比較有特異性的標志物，從形態(tài)、表型變化、基因和蛋白表達水平驗證了黃韌帶干細胞在低氧情況下更有利于向髓核分化，有望成為組織工程種

15、子細胞。
　　2)本實驗進一步研究了低氧下黃韌帶干細胞表達HIF-1α抑制Notch通路下游基因Twist1的表達，Twist1的作用抑制軟骨系分化，故HIF-1α相當于促進了向軟骨系分化的進程，但調控具體機制還需進一步長時間體內證實。
　　3)我們應用流式細胞技術從干細胞分化過程的表型變化入手，鑒定了分化表型的變化。提示在體外分化成某一階段有特定表型，如分化成髓核的祖細胞或前體細胞，既可以維持定向分化又可以降低成瘤的風險。