去神經(jīng)支配對(duì)側(cè)支血管生長(zhǎng)的作用及其機(jī)制的研究.pdf

1、目的:探討去神經(jīng)支配對(duì)大鼠/兔后肢股動(dòng)脈結(jié)扎誘導(dǎo)的側(cè)支血管生長(zhǎng)的影響及其可能的機(jī)制，豐富和完善側(cè)支血管生長(zhǎng)機(jī)制的理論，為缺血性疾病的治療尋找促側(cè)支血管生長(zhǎng)新的途徑。
　　 方法:動(dòng)物模型:成年SD健康大鼠52只和8只新西蘭大白兔，切斷右側(cè)坐骨神經(jīng)，存活1W后重新對(duì)動(dòng)物進(jìn)行麻醉，在腹股溝的深面暴露股動(dòng)脈三角區(qū)域，將股動(dòng)脈分離，在股深動(dòng)脈的稍下方采用雙結(jié)扎法結(jié)扎股動(dòng)脈，同時(shí)在右側(cè)股深動(dòng)脈發(fā)出處用10％的苯酚溶液涂擦將結(jié)扎股動(dòng)脈近側(cè)端

2、的分支神經(jīng)損毀，然后再切斷右側(cè)股神經(jīng)，左側(cè)僅行單純股動(dòng)脈結(jié)扎，建立大鼠/兔后肢股動(dòng)脈結(jié)扎和后肢股動(dòng)脈結(jié)扎結(jié)合坐骨神經(jīng)和股神經(jīng)切除誘導(dǎo)側(cè)支血管生長(zhǎng)模型;單純?nèi)ド窠?jīng)組除不結(jié)扎股動(dòng)脈外，其余步驟同上;
　　 實(shí)驗(yàn)方法及檢測(cè)指標(biāo):第一部分:研究去神經(jīng)支配對(duì)大鼠后肢缺血誘導(dǎo)側(cè)支血管生長(zhǎng)的影響。上述32只大鼠動(dòng)物模型分別存活1W和8W（分別為側(cè)支血管生長(zhǎng)活躍期和成熟期），采用血管造影、組織學(xué)以及共聚焦免疫熒光術(shù)，觀察保留和去神經(jīng)支配對(duì)大鼠后

3、肢側(cè)支血管生長(zhǎng)的影響;
　　 第二部分:研究去神經(jīng)支配對(duì)大鼠/兔后肢股動(dòng)脈結(jié)扎誘導(dǎo)的側(cè)支血管生長(zhǎng)激活的影響。利用上述模型中的12只實(shí)驗(yàn)大鼠和8只實(shí)驗(yàn)新西蘭大白兔，通過共聚焦免疫熒光術(shù)，觀察去神經(jīng)支配對(duì)大鼠/兔后肢側(cè)支血管生長(zhǎng)過程中與炎癥密切相關(guān)的細(xì)胞因子如ICAM（細(xì)胞粘附分子）、VCAM（血管細(xì)胞粘附分子）、MCP-1（單核細(xì)胞趨化因子）和CD11b（單核/巨噬細(xì)胞標(biāo)志物）以及Ki67（細(xì)胞增殖標(biāo)志物）、Vimentin（外膜

4、成纖維細(xì)胞和平滑肌合成表型標(biāo)志物）、MMP-2（基質(zhì)金屬蛋白酶-2）和eNOS（一氧化氮合酶）等表達(dá)的影響;
　　 第三部分:研究神經(jīng)對(duì)側(cè)支血管生長(zhǎng)的可能作用機(jī)制，主要從在體和離體兩方面進(jìn)行研究:①動(dòng)物實(shí)驗(yàn):觀察去神經(jīng)支配后神經(jīng)分泌素(Secretoneurin，SN)在側(cè)支血管生長(zhǎng)中的表達(dá)變化;同時(shí)利用上述大鼠動(dòng)物模型中的8只以10μg/d的SN劑量在大鼠股動(dòng)脈結(jié)扎側(cè)后肢股薄肌處進(jìn)行局部注射，存活1W，通過共聚焦免疫熒光術(shù)，觀

5、察SN對(duì)側(cè)支血管生長(zhǎng)過程中細(xì)胞增殖和單核/巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)的影響。②細(xì)胞培養(yǎng):鑒于血管平滑肌細(xì)胞是側(cè)支動(dòng)脈血管的主要細(xì)胞以及在側(cè)支血管靠近外膜處的平滑肌細(xì)胞表達(dá)VCAM和MCP-1等，故采用大鼠胸主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞體外培養(yǎng)，取5-6代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究，平滑肌細(xì)胞經(jīng)特異性的抗平滑肌細(xì)胞肌動(dòng)蛋白(α-SM actin)抗體鑒定，分為正常對(duì)照組、1ng/ml SN組、10ng/ml SN組、100ng/ml SN實(shí)驗(yàn)組，SN作用24h后，運(yùn)用M

6、TT比色法檢測(cè)不同濃度的SN對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖活性的影響，并采用免疫印跡和免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)SN對(duì)血管平滑肌細(xì)胞表達(dá)VCAM-1（血管細(xì)胞粘附分子）和MCP-1（單核細(xì)胞趨化因子）的影響。
　　 結(jié)果:第一部分:單純股動(dòng)脈結(jié)扎側(cè)，血管造影可見明顯密集呈網(wǎng)狀分布的側(cè)支血管，組織學(xué)和共聚焦免疫熒光術(shù)可見血管壁各層結(jié)構(gòu)發(fā)生重塑，生長(zhǎng)的側(cè)支血管管腔增大，管壁較薄，呈外向性生長(zhǎng)方式的特征，且骨骼肌纖維形態(tài)完好，排列規(guī)則;股動(dòng)脈結(jié)扎加去神

7、經(jīng)側(cè)，側(cè)支血管的數(shù)目雖然比正常增多，但明顯少于單純股動(dòng)脈結(jié)扎側(cè);側(cè)支血管管腔狹窄，管壁變厚，骨骼肌肌纖維出現(xiàn)降解，體積減少，肌間隙增寬。
　　 第二部分:去除神經(jīng)支配后，側(cè)支血管粘附分子ICAM和VCAM在血管內(nèi)皮的表達(dá)下降不明顯，但外膜和靠近外膜的中膜處VCAM和MCP-1的表達(dá)則明顯降低，與此相對(duì)應(yīng)單核/巨噬細(xì)胞（CD11b陽性細(xì)胞）的數(shù)目在血管壁明顯減少;另外，和單純股動(dòng)脈結(jié)扎相比，在側(cè)支血管生長(zhǎng)活躍期外膜成纖維細(xì)胞的數(shù)目

8、較少，MMP-2的表達(dá)較低，而在側(cè)支血管成熟期成纖維細(xì)胞數(shù)目增加，但中膜Vimentin及eNOS的表達(dá)一直呈高水平。
　　 第三部分:①單純股動(dòng)脈結(jié)扎側(cè)，SN免疫陽性神經(jīng)纖維主要表達(dá)在側(cè)支血管外膜，去除神經(jīng)后SN的表達(dá)明顯減少至消失;股動(dòng)脈結(jié)扎+局部注射SN后，側(cè)支血管細(xì)胞增殖的數(shù)目和單核/巨噬細(xì)胞的表達(dá)均明顯增加。②用抗平滑肌細(xì)胞肌動(dòng)蛋白的抗體對(duì)培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞的純度進(jìn)行鑒定，98％的細(xì)胞為α-SM actin免疫陽性細(xì)

9、胞。MTT比色法發(fā)現(xiàn)不同濃度的SN作用后，血管平滑肌細(xì)胞的增殖活性均明顯增強(qiáng);免疫細(xì)胞化學(xué)和免疫印跡均顯示SN能刺激血管平滑肌細(xì)胞VCAM和MCP-1的表達(dá)明顯上調(diào)。
　　 結(jié)論:①在大鼠/兔后肢股動(dòng)脈結(jié)扎誘導(dǎo)的側(cè)支血管生長(zhǎng)模型，去除神經(jīng)支配后，側(cè)支血管的數(shù)目減少，血管管壁增厚，管腔變窄呈內(nèi)向性的生長(zhǎng)方式，導(dǎo)致血流減少供血不足，造成骨骼肌的缺血和損害;②去神經(jīng)支配導(dǎo)致血管壁特別是外膜SN和細(xì)胞因子(VCAM和MCP-1)的表達(dá)下