睪丸去神經(jīng)支配對(duì)雄性生殖細(xì)胞的影響及其機(jī)制.pdf

1、目的： 研究睪丸支配神經(jīng)(精索神經(jīng))在睪丸組織內(nèi)的分布特征及去神經(jīng)支配后對(duì)雄性生殖細(xì)胞凋亡與分化的影響，以及對(duì)性激素分泌的影響。 方法 1)免疫組織化學(xué)ABC法，以特異性的抗體標(biāo)記人睪丸組織內(nèi)蛋白基因產(chǎn)物9.5(PGP9.5)、C末端神經(jīng)多肽Y(CPON)、神經(jīng)肽Y(NPY)和血管活性腸肽(VIP)等肽能神經(jīng)，了解其在人睪丸組織內(nèi)的分布特點(diǎn)2)通過(guò)顯微外科技術(shù)，同時(shí)切除SD大鼠(300-350g)精索上神經(jīng)和精索

2、下神經(jīng)，分別于1、4、8天采取睪丸組織，采用脫氧核搪核酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP的缺口末端標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)觀察精原細(xì)胞和Leydig細(xì)胞的凋亡情況。 3)切除精索神經(jīng)對(duì)性激素的影響，解剖顯微鏡下建立睪丸去神經(jīng)支配大鼠模型，分別于術(shù)前7天、術(shù)后1、7、14、21天和術(shù)后28天進(jìn)行麻醉下大鼠眼眶后靜脈叢處取血，放射性免疫的方法檢測(cè)血清中睪酮(T)、卵泡刺激素(FSH)、黃體生成素(LH)、泌乳素(PRL)扣雌二醇(E2)的濃度

3、.了解性激素分泌的變化. 4)以EDS建立Leydig細(xì)胞特異性敲除模型，不同劑量EDS腹腔內(nèi)注射給藥，注射后3天、7、14天處死大鼠，取出睪丸組織，行HE染色光鏡下組織學(xué)觀察和P450sce免疫組化觀察及灰度分析。觀察Leydig細(xì)胞特異性敲除情況。 結(jié)果： 1)PGP9.5肽能神經(jīng)和CPON肽能神經(jīng)主要分布在睪丸間質(zhì)內(nèi)，與曲細(xì)小管相鄰，CPON陽(yáng)性纖維尚見(jiàn)于血管周圍，其分布密度低于PGP9.5；NPY肽能神經(jīng)

4、在人睪丸實(shí)質(zhì)內(nèi)主要見(jiàn)于睪丸血管周圍；Ⅷ肽能神經(jīng)在睪丸實(shí)質(zhì)內(nèi)未見(jiàn)分布。 2)術(shù)后1、4、8天，精原細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞均發(fā)生顯著凋亡。其中精原細(xì)胞的凋亡峰值出現(xiàn)在術(shù)后第一天，間質(zhì)細(xì)胞的凋亡在這3個(gè)時(shí)點(diǎn)沒(méi)有明顯差異. 3)血清中睪酮測(cè)定：去精索神經(jīng)組術(shù)后睪酮持續(xù)下降，與手術(shù)前相比差異有顯著性(p<0.05)，去精索上下神經(jīng)組較去精索上神經(jīng)組和去精索下神經(jīng)組睪酮下降更為明顯，于28天時(shí)有顯著差異性(P<0.05)；血清中的黃體生成素

5、測(cè)定：去精索神經(jīng)組術(shù)后黃體生成素持續(xù)上升，與手術(shù)前相比差異有顯著性(P<0.05)，去精索上下神經(jīng)組較去精索上神經(jīng)組和去精索下神經(jīng)組上升更為明顯，于28天時(shí)有顯著差異性(P<0.05)；血清中的卵泡刺激素測(cè)定：均于手術(shù)后1天迅速升高(P<0.05)，此后逐漸降低至手術(shù)前的水平；血清中泌乳素測(cè)定：去精索神經(jīng)各組血清中泌乳素于手術(shù)后逐漸升高，術(shù)后28天達(dá)最高，其中去精索下神經(jīng)組術(shù)后21天和術(shù)后28天與術(shù)前比差異有顯著性(P<0.05)，去精

6、索上神經(jīng)組術(shù)后14天、術(shù)后21天和術(shù)后28天與術(shù)前比差異有顯著性(P<0.05)，去精索上下神經(jīng)組術(shù)后1天、術(shù)后7天、術(shù)后14天、術(shù)后21天和術(shù)后28天與術(shù)前比差異有顯著性(P<0.05)；血清中雌二醇測(cè)定：去精索神經(jīng)各組血清中雌二醇均于術(shù)后1天急劇下降并于術(shù)后14天降至最低(P<0.05)，而后稍有回升并保持穩(wěn)定，但是仍低于手術(shù)前(P<0.05)。 4)EDS處理3天后，均觀察到Leydig細(xì)胞的減少，其中40mg/kg劑量組

7、的減少程度不明顯；EDS處理后7天，曲細(xì)精管內(nèi)生精細(xì)胞出現(xiàn)排列紊亂的現(xiàn)象，以90mmg/kg劑量組更為明顯；EDS處理后14天，60mg/kg劑量組出現(xiàn)一種核圓形、核染色淡、體積較大的新形成Leydig細(xì)胞，而在75mg/kg劑量組沒(méi)有發(fā)現(xiàn)此細(xì)胞。P450scc免疫組化與光鏡結(jié)果一致.灰度分析結(jié)果顯示，EDS處理后3天及7天，各劑量組與正常對(duì)照相比差異均有顯著性(P<0.05)；60mg/kg劑量組14天與3天，7天相比差異有顯著性(P

8、<0.05)，且與正常對(duì)照差異無(wú)顯著性(P>0.05)。 結(jié)論 1)人睪丸間質(zhì)內(nèi)分布著PGP9.5、 CPON和NPY肽能神經(jīng)纖維，為精索神經(jīng)參與精子發(fā)生過(guò)程提供形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。 2)在睪丸去神經(jīng)早期階段，精原細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞即有大量凋亡，這可能是去神經(jīng)支配后期睪丸組織發(fā)生病理改變的重要原因。 3)睪丸去精索神經(jīng)支配對(duì)大鼠性激素的產(chǎn)生有明顯的影響，精索神經(jīng)對(duì)精子的發(fā)生具有重要的調(diào)控作用。 4)EDS確實(shí)