去神經支配后對鼠肺神經內分泌細胞影響的實驗研究.pdf

1、肺神經內分泌細胞（PNEC）系統是由單個PNEC及成簇的PNEC形成的神經上皮小體（NEB）組成。已知PNEC具有氣道氧化學感受器，調節(jié)氣道反應性，促進肺的生長發(fā)育的功能。近來還發(fā)現PNEC可作為氣道上皮干細胞促進肺損傷后修復，PNEC與小細胞肺癌密切相關。這些功能的發(fā)揮主要通過迷走神經節(jié)的感覺傳入神經纖維支配。
　　NEB中存在雙重感覺神經纖維支配。一是由迷走神經結狀神經節(jié)的鈣結合蛋白D28K和P2X3受體免疫神經纖維組成的感覺

2、神經纖維；另一是由背根神經節(jié)的P物質和降鈣素基因相關肽（CGRP）免疫反應性神經纖維組成。CGRP在神經節(jié)中合成后隨之被轉運到神經末梢，通過迷走神經傳入神經元調節(jié)其行為。從氣道近端至遠端雙重感覺神經纖維的密度逐漸降低直至單個神經纖維穿過氣道上皮及上皮下層，單個PNEC及NEB可能通過粘膜下層的微細神經纖維相互連接。單側迷走神經切斷后會出現同側的神經末梢退化或消失，PNEC及NEB也可能會出現相應改變。
　　臨床在氣管、支氣管成形術

3、及肺移植過程中，由于切斷了支配支氣管粘膜及肌肉的神經纖維，去神經支配后肺神經內分泌細胞的數量、分布及神經活性物質分泌功能的改變；PNEC對于神經刺激的應答，PNEC產生的神經免疫、神經內分泌的功能，以及這些改變對于氣管、支氣管粘膜的修復有何影響？目前尚不清楚。因此，研究去神經支配后肺神經內分泌細胞數量、分布及神經活性物質的分泌功能的改變，具有十分重要的意義。
　　研究目的
　　通過切斷鼠單側迷走神經和支氣管重建觀察去神經后P

4、NEC和NEB的數量、形態(tài)結構及其分泌神經活性物質的變化，以探討PNEC的功能及其在氣道損傷及修復中的作用。
　　實驗方法
　　1．30只SD大鼠切斷左側迷走神經，術后按取樣時間隨機分為術后一周、一月、三月組，每組10只；另設10只正常SD大鼠作為對照組。電鏡觀察肺神經內分泌細胞的超微結構；采用Grimelius銀染色法觀察肺神經內分泌細胞數量及分布；免疫組化法檢測五羥色胺陽性神經內分泌細胞、降鈣素基因相關肽陽性神經內分泌細

5、胞的表達；采用放射免疫分析法測定血清中CGRP濃度；RT-PCR法測定肺組織CGRPmRNA表達。
　　2．30只SD大鼠左側支氣管重建術，術后按取樣時間隨機分為術后一周、一月、三月組，每組10只；另設10只正常SD大鼠作為對照組。HE切片觀察支氣管重建術后支氣管愈合情況；采用Grimelius銀染色法觀察肺神經內分泌細胞數量及分布；免疫組化法檢測五羥色胺陽性神經內分泌細胞、降鈣素基因相關肽陽性神經內分泌細胞的表達；采用放射免疫分

6、析法測定血清中CGRP濃度；RT-PCR法測定肺組織CGRPmRNA表達。
　　實驗結果
　　1．PNEC超微結構：電鏡下見PNEC分布于肺內支氣管和細支氣管上皮內，PNEC呈燒瓶樣、卵圓形和錐型，細胞從上皮基底膜延伸至支氣管管腔或者沿基底膜在相鄰氣道上皮間伸展，頂端狹窄形成尖形突起抵達管腔，有些細胞頂端靠近腔面處常有短微絨毛。在細胞漿中富含具有特征性的致密核心小泡（DCV），一般呈球狀，直徑約70～200nm，外被單位膜，

7、內含電子高密度的核心，核心和膜之間有一薄的光暈。PNEC內可見數量不等的游離核蛋白體、光面內質網與粗面內質網、成束的微絲和線粒體，線粒體較相鄰細胞的更小，高爾基體位于細胞核靠上處。
　　2．迷走神經切斷術后一周和一月Grimelius銀染色見神經內分泌細胞多位于肺內支氣管上皮，其數量大幅度增加，且有多個神經內分泌細胞聚集形成神經上皮小體；至三月接近正常對照組；進一步免疫組化檢測見迷走神經切斷術后一周、一月大支氣管內5-HT、CGR

8、P陽性PNEC和NEB數量大量增加（P﹤0.01），至術后三月時接近正常對照組（P﹥0.05）。小支氣管、周圍細支氣管內5-HT、CGRP陽性PNEC和NEB數量無顯著差異（P﹥0.05）。
　　3．迷走神經切斷術后一周和一月血清CGRP含量比正常對照組顯著降低（P﹤0.01），隨著時間延長，血清中CGRP含量逐漸增加，至三月時接近正常對照組；而肺組織CGRPmRNA表達在術后一周和一月均明顯高于對照組（P﹤0.01），隨著時間的

9、延長，其表達量逐漸減少，至術后三月時接近正常對照組（P﹥0.05）。
　　4．支氣管重建術后支氣管吻合口肉芽組織增生，可見支氣管粘膜中斷，內皮細胞增生形成的實性細胞索及擴張的毛細血管，毛細血管周圍可見大量的纖維母細胞及炎性細胞。
　　5．支氣管重建術后一周和一月Grimelius銀染色見神經內分泌細胞多位于肺內支氣管上皮，其數量大幅度增加，且有多個神經內分泌細胞聚集形成神經上皮小體；至三月接近正常對照組；進一步免疫組化檢測見

10、支氣管重建術后一周、一月大支氣管內5-HT、CGRP陽性PNEC和NEB數量大量增加（P﹤0.01），至術后三月時接近正常對照組（P﹥0.05）。小支氣管、周圍細支氣管內5-HT、CGRP陽性PNEC和NEB數量無顯著差異（P﹥0.05）。6．支氣管重建術后一周和一月血清CGRP含量比正常對照組顯著降低（P﹤0.01），隨著時間延長，血清中CGRP含量逐漸增加，至三月時接近正常對照組；而肺組織CGRPmRNA表達在術后一周和一月均明顯高

11、于對照組（P﹤0.01），隨著時間的延長，其表達量逐漸減少，至術后三月時接近正常對照組（P﹥0.05）。
　　結論
　　1．神經內分泌細胞的超微結構特征——細胞漿中致密核心小泡（DCV）可作為PNEC特征性標志。
　　2．迷走神經切斷后可明顯影響肺神經內分泌細胞數量、分布及神經活性物質的分泌，從而表明迷走神經具有支配、調節(jié)肺神經內分泌細胞分化及分泌神經活性物質的功能。
　　3．迷走神經切斷后血清內CGRP濃度下降

12、及肺內CGRPmRNA表達量增加之變化，表明迷走神經對CGRP基因的表達和神經活性物質CGRP的分泌具有調節(jié)作用。
　　4．支氣管重建術后PNEC的數量增加及5-HT，CGRP陽性PNEC和NEB大量增生，一方面表明PNEC受其支配的神經纖維調節(jié)，另一方面表明PNEC可能參與了氣道的損傷與修復。
　　5．支氣管重建術后近期血清內CGRP濃度下降及肺內CGRPmRNA表達量增加之變化，表明肺內CGRP-IR神經纖維調節(jié)CGRP