SARS冠狀病毒Spike蛋白預(yù)處理對細(xì)菌內(nèi)毒素介導(dǎo)的肺細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響.pdf

1、研究背景和目的：
　　 嚴(yán)重急性呼吸綜合征、H5N1禽流感、甲型H1N1流感等呼吸道病毒感染引起的呼吸系統(tǒng)重大傳染病，具有傳播迅速、人群普遍易感、高死亡率的特點，給人們的健康帶來重大威脅。近年來的研究表明：
　　 呼吸道病毒感染致死的主要原因是病毒感染后繼發(fā)的細(xì)菌感染。然而，呼吸道病毒感染繼發(fā)細(xì)菌感染的機(jī)制至今尚不清楚。我們在前期的研究工作中發(fā)現(xiàn)：SARS-冠狀病毒Spike蛋白可以引起宿主固有免疫應(yīng)答的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路JA

2、K-STAT的激活，導(dǎo)致肺部免疫病理損傷，gamma-干擾素可誘導(dǎo)的10Kda蛋白是介導(dǎo)免疫炎癥的重要分子，JAK3抑制劑對損傷具有防治作用。在SARS死亡病人中繼發(fā)條件致病菌感染是一個普遍現(xiàn)象。我們推測病毒感染引起的免疫損傷可能是導(dǎo)致細(xì)菌易感性的主要原因。本課題體外模擬人體病毒感染后繼發(fā)細(xì)菌感染的過程，通過S蛋白預(yù)處理人支氣管上皮細(xì)胞，觀察清除病毒抗原蛋白條件下，繼而的細(xì)菌內(nèi)毒素作用對細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響，揭示其可能的機(jī)制與防治靶點。<

3、br>　　 研究內(nèi)容和方法：
　　 第一部分：SARS冠狀病毒S蛋白作用于人支氣管上皮細(xì)胞對JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)分子表達(dá)的影響
　　 1.應(yīng)用昆蟲－桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)SARS冠狀病毒S蛋白，并經(jīng)鎳親和磁珠法純化，western－blot鑒定純化的S蛋白。
　　 2.用純化的S蛋白作用于16HBE細(xì)胞，免疫熒光觀察不同的作用時間JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)分子的變化。
　　 第二部分：S

4、ARS 冠狀病毒S蛋白預(yù)處理16HBE細(xì)胞對LPS介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)及JAK3抑制劑的影響
　　 1.16HBE細(xì)胞分為對照組（S-LPS-，A1組）、S蛋白預(yù)處理組(S+LPS-，A2組)、單獨LPS處理組（S-LPS+，A3組）和S蛋白預(yù)處理-LPS處理組（S+LPS+，A4組）。
　　 S蛋白40ug/ml加入A2和A4組處理12h，PBS洗滌去除S蛋白，繼而在A4組加入LPS20ug/ml，與此同時在A3 組添加同樣

5、濃度的LPS處理。各組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)12h，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，液相芯片技術(shù)檢測細(xì)胞因子和趨化因子的變化，觀察S蛋白預(yù)處理細(xì)胞對后續(xù)LPS處理產(chǎn)生細(xì)胞因子和趨化因子的影響。
　　 2.按上一步的分組處理后，將新鮮分離的外周血單個核細(xì)胞（PBMCs）加入趨化小室上室，15min后顯微鏡下隨機(jī)選取15個視野進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，觀察不同組別產(chǎn)生的趨化因子對PBMCs的趨化作用。
　　 3.將A1～A4組細(xì)胞上清分別以三分之一體積與三分之

6、二體積的無血清1640培養(yǎng)基混合后，與PBMCs共孵育12h，PBS洗滌后以含5％胎牛血清的1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12h，收集上清進(jìn)行液相芯片技術(shù)檢測，觀察不同組別處理對PBMCs產(chǎn)生細(xì)胞因子和趨化因子的影響。
　　 4.將16HBE細(xì)胞分為對照組（C1組）、S蛋白預(yù)處理-LPS處理組（C2組）、S蛋白＋抑制劑預(yù)處理-LPS處理組（C3組），其中JAK3抑制劑為760nM，隨S蛋白40ug/ml一起加入，作用于細(xì)胞12h后PBS

7、洗滌去除，LPS用法及用量同前，收集細(xì)胞上清，液相芯片技術(shù)檢測不同組別細(xì)胞因子及趨化因子的變化，觀察JAK3抑制劑對S蛋白預(yù)處理后LPS介導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞釋放細(xì)胞因子和趨化因子的作用。
　　 5.將C1～C3組細(xì)胞上清分別以三分之一體積與三分之二體積的無血清1640培養(yǎng)基混合后，與PBMCs共孵育12h，PBS洗滌后以含5％胎牛血清的1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12h，收集上清進(jìn)行液相芯片技術(shù)檢測，觀察不同組別處理對PBMCs產(chǎn)生細(xì)胞因

8、子和趨化因子的影響。
　　 結(jié)果：
　　 第一部分：SARS冠狀病毒S蛋白作用于16HBE細(xì)胞對JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)分子表達(dá)的影響
　　 1．應(yīng)用昆蟲－桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)并經(jīng)鎳親和磁珠法純化的S蛋白，經(jīng)western－blot鑒定為SARS 冠狀病毒S蛋白。
　　 2.免疫熒光發(fā)現(xiàn)S蛋白作用于16HBE細(xì)胞可引起JAK-STAT通路JAK2、JAK3、STAT1、STAT5等分子的激活；ST

9、AT1、STAT5陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)在S蛋白作用后30min、45min、1h較未加S蛋白組明顯增多，陽染細(xì)胞免疫熒光由胞漿向胞核聚集，以45min時最為顯著；JAK2、JAK3分子陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)量在S蛋白處理后15min、30min亦較未處理組明顯增多。
　　 第二部分：SARS冠狀病毒S蛋白預(yù)處理16HBE細(xì)胞對LPS介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)及JAK3抑制劑的影響
　　 1.液相芯片檢測發(fā)現(xiàn)S 蛋白預(yù)處理組(S+LPS-，A2組)

10、、單純LPS處理組（S-LPS+，A3 組）釋放IL-6、IL-8因子的水平較對照組（S-LPS-，A1組）明顯升高：A1組（8.23±1.57；9.66±1.53pg/ml）、A2 組（87.17±7.8；22.25±0.44pg/ml）、A3組（63.16±1.07；43.82±4.38pg/ml），P值均<0.01；IP-10、RANTES因子釋放在A2組較A1組明顯升高：A1組（8.07±1.79；0.99±0.1pg/ml）、

11、A2組（418.59±76.63；158.1±23.37 pg/ml），P值<0.01；S蛋白預(yù)處理-LPS 處理組（S+LPS+，A4組）上述因子的釋放水平（依次為417.64±30.43；128.75±6.55；1305.45±35.17；187.05±18.46pg/ml）較單純S蛋白預(yù)處理組和LPS處理組明顯增高，P<0.01。
　　 2.S蛋白預(yù)處理組（50.66±13.93 PBMCs/視野）、LPS處理組（44±1

12、7.1PBMCs/視野）對PBMCs的趨化作用較對照組（3.2±4.81 PBMCs/視野）明顯增強(qiáng)，且S蛋白預(yù)處理-LPS 處理組（77.46±8.69 PBMCs/視野）比單純S 蛋白預(yù)處理組和LPS處理組的趨化作用更顯著，P<0.01。
　　 3.液相芯片檢測發(fā)現(xiàn)：S 蛋白預(yù)處理氣道上皮細(xì)胞（A2 組）培養(yǎng)上清摻入較正常氣道上皮細(xì)胞（A1 組）上清摻入培養(yǎng)的PBMCs 釋放IFN-γ、MIP-1α、TNF-α等因子的水平明

13、顯增高：正常氣道上皮細(xì)胞上清摻入組（IFN：21.33±11.31 pg/ml；MIP-1α：檢測不到；TNF-α：22.3±1.91 pg/ml）、S 蛋白預(yù)處理氣道上皮細(xì)胞上清摻入組（57±26.09；171.18±0.2；29.8±4.76pg/ml），P 均<0.05；而S 蛋白預(yù)處理-LPS 處理氣道上皮上清摻入組PBMCs上述因子的釋放水平（102.4±6.4；223.15±20.86；65.5±5.39pg/ml）較單純S

14、 蛋白預(yù)處理氣道上皮上清摻入組明顯增高，P<0.05；PBMCs 釋放IP-10在S蛋白預(yù)處理氣道上皮細(xì)胞培養(yǎng)上清摻入組（639.8±62.5pg/ml）較正常氣道上皮細(xì)胞上清摻入組（檢測不到）明顯增高，P<0.01，但與S蛋白預(yù)處理-LPS處理氣道上皮上清摻入組（668.6±86.88 pg/ml）相比，兩組間無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 4.液相芯片檢測發(fā)現(xiàn)S蛋白＋抑制劑預(yù)處理-LPS處理組較S蛋白預(yù)處理-LPS處理組IL-8、IP

15、-10、rantes等因子釋放水平明顯降低：S蛋白＋抑制劑預(yù)處理-LPS處理組（71.72±3.2；713.86±27.9；77.94±1.53pg/ml）、S蛋白預(yù)處理-LPS處理組（128.75±6.55；1305.45±35.17；187.05±18.46pg/ml），P<0.01。
　　 5.液相芯片檢測發(fā)現(xiàn)S 蛋白＋抑制劑預(yù)處理-LPS 處理組細(xì)胞上清摻入組較S 蛋白預(yù)處理-LPS 處理組PBMCs 釋放IFN-γ的水

16、平降低，分別為84.50±9.97 pg/ml、102.40±6.4 pg/ml，P<0.05。
　　 結(jié)論：
　　 1.SARS冠狀病毒S蛋白預(yù)處理促進(jìn)了細(xì)菌內(nèi)毒素LPS介導(dǎo)的氣道上皮炎癥反應(yīng)。
　　 2.S蛋白刺激過的氣道上皮細(xì)胞能夠促進(jìn)外周血單個核免疫細(xì)胞的趨化，增加免疫細(xì)胞釋放炎癥因子的能力，并且顯著增強(qiáng)了免疫細(xì)胞對少量細(xì)菌內(nèi)毒素的炎癥反應(yīng)。
　　 3.SARS冠狀病毒S蛋白誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞釋放I