腫瘤壞死因子相關(guān)誘導(dǎo)凋亡配體聯(lián)合絲裂霉素C治療膀胱癌的實驗研究.pdf

1、第一部分腫瘤壞死因子相關(guān)誘導(dǎo)凋亡配體以及聯(lián)合絲裂霉素C對人膀胱癌細(xì)胞作用的體外實驗 目的:檢測腫瘤壞死因子相關(guān)誘導(dǎo)凋亡配體(TRAIL)對人膀胱癌細(xì)胞株體外生長的抑制作用和凋亡作用，以及TRAIL聯(lián)合絲裂霉素C(MMC)治療膀胱癌的協(xié)同作用。 方法:人膀胱癌細(xì)胞株T24、5637體外培養(yǎng)。將T24、5637膀胱癌細(xì)胞接種至96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24h后分別加入濃度為1、10、100μg/L的TRAIL，0.1、1.0、10.

2、0mg/L的MMC，不同濃度TRAIL和MMC作用24h，采用噻唑藍(lán)比色(MTT)法分別檢測膀胱癌細(xì)胞的生存率，并將單獨用TRAIL、MMC與TRAIL聯(lián)合MMC對膀胱癌細(xì)胞株T24、5637的生長抑制情況進行比較；將T24及5637膀胱癌細(xì)胞接種至12孔板，培育24小時后加入不同濃度的TRAIL、MMC、TRAIL聯(lián)合MMC并作用12h，用流式細(xì)胞術(shù)檢測不同處理組膀胱癌細(xì)胞的凋亡率和死亡率，并將單獨用TRAIL、MMC與TRAIL聯(lián)合

3、MMC組進行比較。 結(jié)果:TRAIL能有效抑制人膀胱癌細(xì)胞株T24、5637的生長。①MTT實驗結(jié)果：1、10、100μg/L的TRAIL對膀胱癌T24細(xì)胞的抑制率分別為26.4％、29.3％和37.7％，與無藥物組比較差異有顯著性。三種濃度的TRAIL對膀胱癌5637細(xì)胞的抑制率分別為13.7％、21.9％和59.1％，1μg/LTRAIL組與無藥物組比較差異無顯著性，10、100μg/L TRAIL組與無藥物組比較差異有顯著

4、性。10.0mg/LMMC對膀胱癌T24、5637細(xì)胞的抑制率分別為36.0％、26.7％：而100μg/L TRAIL聯(lián)合10.0 mg/L MMC組對膀胱癌T24、5637細(xì)胞的抑制率分別達(dá)到58.4％、90.7％，聯(lián)合用藥有明顯的協(xié)同作用，與單純100μg/L TRAIL組、單純10.0 mg/L MMC組相比差異有顯著性。②流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果：100μg/L TRAIL引起膀胱癌T24、5637細(xì)胞的凋亡，凋亡率分別為20.1％

5、、47.5％，與無藥物組1.9％、5.1％的凋亡率相比差異有顯著性；10.0mg/L MMC對膀胱癌T24、5637細(xì)胞的凋亡率分別為13.1％、18.1％；而100μg/L TRAIL聯(lián)合10.0 mg/L MMC組對膀胱癌T24、5637細(xì)胞的凋亡率分別達(dá)到41.5％、61.5％，兩者有明顯的協(xié)同作用，與單純100μg/L TRAIL組、單純10.0 mg/L MMC組相比差異有顯著性。 結(jié)論在體外實驗中，①TRAIL能有效

6、地抑制人膀胱癌細(xì)胞株T24、5637的生長，誘導(dǎo)人膀胱癌細(xì)胞株T24、5637凋亡；②TRAIL聯(lián)合MMC抑制人膀胱癌細(xì)胞株T24、5637生長和誘導(dǎo)人膀胱癌細(xì)胞株T24、5637凋亡具有協(xié)同作用。 第二部分 Ad-TRAIL以及聯(lián)合MMC對膀胱癌作用的在體實驗 目的：建立人膀胱癌細(xì)胞株T24 BALB/c-nu小鼠皮下移植瘤模型；在體研究真核表達(dá)載體Ad-TRAIL轉(zhuǎn)染T24膀胱癌組織的效果及其對膀胱癌的治療作用，以及

7、聯(lián)合MMC治療膀胱癌的協(xié)同作用。 方法：①人膀胱癌細(xì)胞株T24體外培養(yǎng)。6周齡免疫缺陷小鼠(BALB/c-nu)共5只。在超凈臺內(nèi)將小鼠右側(cè)前肢根部背側(cè)皮膚用75％酒精消毒后皮下接種0.2ml濃度為1×107個/ml的T24人膀胱癌細(xì)胞株懸液，等上述接種小鼠的腫瘤長至直徑1cm大小時，處死小鼠，切取腫瘤。再切開腫瘤，取質(zhì)地均勻處組織，切成2mm3，10～15mg大小，分別移植至40只6周齡BALB/c-nu小鼠右前肢根部背側(cè)皮下

8、，每只小鼠移植1塊。移植方法：先用75％酒精消毒移植處皮膚，切一0.4cm大小的皮膚切口，分離皮下組織，將組織塊植入皮下，0號線縫合皮膚切口。繼續(xù)按常規(guī)飼養(yǎng)小鼠并觀察注射部位的變化。②上述BALB/c-nu小鼠模型40只，腫瘤長到0.4～0.6cm后隨機分成四組，分別為單用MMC組(A組)：腹腔注射0.1g/L MMC(10μl/g重)，連續(xù)注射7d；瘤內(nèi)注射5×108 pfu/ml Ad空載體0.1ml×3處，分別注射于腫瘤的4、8、

9、12點，1次/2d，共3次；單用Ad-TRAIL組(B組)：腹腔注射PBS(10μl/g體重)×7d，瘤內(nèi)注射5×108 pfu/mlAd-TRAIL0.1ml×3處，1次/2d，共3次；聯(lián)合Ad-TRAIL和MMC組(C組)：瘤內(nèi)注射Ad-TRAIL同B組，腹腔注射MMC同A組；對照組(D組)：腹腔注射PBS(10μl/g體重)×7d，瘤內(nèi)注射5×108 pfu/ml Ad空載體0.1ml×3處，1次/2d，共3次。給藥結(jié)束2周后脫頸

10、處死荷瘤鼠，測量小鼠體重，所荷腫瘤的直徑和重量。取出腫瘤制成常規(guī)病理切片觀察。用RT-PCR和Western blot測量腫瘤組織內(nèi)TRAIL mRNA及TRAIL蛋白的表達(dá)水平。 結(jié)果：①第一批5只小鼠，有3只荷瘤模型建立成功，至細(xì)胞注射后50d，3只小鼠荷瘤直徑達(dá)0.6～1.0cm，并經(jīng)病理組織學(xué)證實；第二批40只小鼠腫瘤模型建立全部成功，成瘤率達(dá)100％，移植后4周所有小鼠腫瘤直徑在0.4～0.6cm。②四組小鼠給藥前體重

11、及所荷腫瘤平均直徑差異無統(tǒng)計學(xué)意義；給藥結(jié)束2周后， A、B、C組所荷腫瘤直徑和重量均顯著小于D組，而C組又顯著小于A、B組，B組又顯著小于A組； A、C組體重均顯著小于D組，而B組和D組差異無統(tǒng)計學(xué)意義；腫瘤組織病理切片鏡下觀察，組織壞死由多到少依次為C組、 B組、A組和D組；B、C組腫瘤組織內(nèi)均有TRAIL mRNA和TRAIL蜃白的表達(dá)，且兩組間表達(dá)相對量差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而A、D組則無TRAIL mRNA和TRAIL蛋白的表達(dá)。