干擾素epsilon及腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體治療人卵巢癌的體外研究.pdf

1、山西醫(yī)科大學碩士學位論文干擾素epsilon及腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體治療人卵巢癌的體外研究姓名：安紅梅申請學位級別：碩士專業(yè)：婦產(chǎn)科學指導教師：郝敏20070508沒有明顯的殺傷作用，這一特殊的選擇性使其在腫瘤治療中具有很廣的應用前景。目的：以cDNA為模板，通過RTPCR方法擴增獲得TRA／L基因，并構建其真核表達載體pEGFPN3TRAIL。方法：收集急性早幼粒細胞白血病細胞系HL60細胞約4106個，用RNA抽提試劑盒提取細

2、胞總RNA，將其中的mRNA反轉錄為cDNA第一鏈，再以cDNA為模板獲得目的基因，其反應產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，經(jīng)DNA凝膠回收試劑盒回收純化后酶切，回收酶切產(chǎn)物，插入經(jīng)相同酶切的質粒pEGFPN3中，連接酶連接過夜，構建成真核表達載體pEGFPN3TRAIL，通過酶切后電泳鑒定，經(jīng)測序證實其插入序列的正確性。結果：l、TRA／L基因的提?。篐L—60細胞的RTPcR產(chǎn)物經(jīng)1％的瓊脂糖凝膠電泳，可見在865bp處有一條清楚的條帶

3、。2、表達質粒的構建：提取重組質粒DNA，經(jīng)XhoI和EcoRI雙酶切后，凝膠電泳，可見兩條清楚條帶；47kb為pEGFPN3質粒，865bp為插入的TRA／L目的基因，測序證實目的基因刀翻，上以讀框融合的方式插入表達質粒pE6FPN3，并與Genebank中報道的豫4尼序列一致。結論：本實驗成功提取了基因TRA／L并構建了其真核表達載體，經(jīng)酶切和測序證實正確，為進一步研究TRAⅡ，對卵巢癌細胞的作用奠定了基礎。關鍵詞：RTPCR，TR

4、AIL，基因克隆第三部分轉染重組質粒對卵巢癌細胞作用的體外研究目的：初步探討轉染真核表達質粒pEGFPN3TRAIL和PcDNA31IFN￡后對卵巢癌細胞的體外作用及其機制。方法：人卵巢癌細胞株SKOv3體外培養(yǎng)達對數(shù)生長期時，采用脂質體轉染真核表達載體，實驗分為六組進行：pEGFPN3TRAIL轉染組，PcDNA31IFN6轉染組，兩者聯(lián)合轉染組，空質粒pEGFPN3轉染，PcDNA31轉染組，PBS對照組。采用MTT法測定不同轉染組

5、對人卵巢癌細胞的生長抑制作用，流式細胞術觀察兩者作用于卵巢癌細胞后的細胞凋亡情況，RTPCR檢測不同轉染組Survivin的表達水平。結果：pEGFPN3TRAIL和PcDNA31IFN噸轉染48小時后，可見卵巢癌細胞體積縮小，細胞間連接減少，細胞內顆粒增多，部分呈懸浮狀態(tài)；pEGFPN3TRAIL轉染組細胞內可清楚看到綠色熒光蛋白的表達。轉染24h，48h，96h后PcDNA31IFN￡轉染組細胞的生長抑制率分別為1453％，3019

6、％、4505％，明顯高于周一時間PcDNA31空質粒轉染組O51％、384％、695％)和PBS對照組(167％、249％、308％)(P001)；pEGFPN3TRAIL轉染組細胞生長抑制率分別為1800％，2551％、4743％，明顯高于同一時間pEGFPN3空質粒轉染組(503％、497％、760呦和PBS對照組(PO01)；pEGFPN3TRAILPcDNA3IIFN8轉染組的卵巢癌細胞生長抑制率分別為3668％、5643％、7