胃癌血管靶向肽GX1修飾的人血清白蛋白用于胃癌近紅外活體成像.pdf

1、胃癌是我國的常見腫瘤之一，嚴重威脅人民群眾的身體健康。胃癌患者5年生存率嚴重依賴于診斷時分期，但是，早期胃癌常無典型癥狀，發(fā)病隱匿，多數(shù)患者在確診時已處于疾病晚期，提高胃癌早期診斷的敏感度和特異性成為重要課題。目前，胃癌早期診斷依賴于內(nèi)鏡下活檢結(jié)合免疫組織化學染色檢查，診斷的敏感性和特異性有待進一步提高。在胃癌的早期診斷方式中，使用內(nèi)窺鏡有特殊的優(yōu)勢，特別是使用內(nèi)窺鏡結(jié)合光學分子影像技術(shù)，在細胞和分子水平靶向腫瘤成像，可以進一步提高診斷

2、的敏感性和特異性，因而成為關(guān)注的焦點，而分子探針是成功進行分子影像成像的關(guān)鍵之一。雖然已研究出多種探針成功用于小動物活體成像，但是由于毒性高、靶向特異性低、儀器設備和探針成本高昂等原因，難以用于臨床。因此，合成安全、具有較高生物相容性、低成本、高效靶向特異性并且具有一定臨床應用轉(zhuǎn)化能力的胃癌靶向分子探針具有重要意義。近紅外熒光（near-infrared fluorescence，NIRF）成像，是具有活體自發(fā)熒光影響少、組織對光散射較

3、弱，良好的組織穿透性，以及成像設備可結(jié)合內(nèi)窺鏡應用等優(yōu)點的光學成像方式。GX1為隨機噬菌體肽庫體內(nèi)篩選法在活體內(nèi)所篩選出的環(huán)狀短肽，前期研究已證實GX1在活體內(nèi)具有良好的胃癌血管靶向性，并可攜帶核素或者熒光染料進行活體成像。FDA所批準,臨床用于血管成像的近紅外熒光染料吲哚菁綠（indocyanine green，ICG）為常見的NIRF成像示蹤劑，內(nèi)源性蛋白人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）可以作為ICG的

4、載體。
　　【目的】
　　以HSA作為ICG的載體，GX1對HSA進行表面修飾，合成胃癌血管靶向特異性的近紅外熒光探針GX1-HSA-ICG，對其進行表征，并研究其作為近紅外熒光探針在體外細胞和荷人胃癌裸鼠活體中的靶向成像能力。
　　【方法】
　　1. HSA作為ICG載體，在EDC和sulfo-NHS活化下GX1與HSA共價連接，合成GX1-HSA-ICG納米顆粒探針；
　　2.使用 SDS-PAGE和考

5、馬斯亮藍染色對探針合成進行鑒定；紫外-可見光譜掃描以確認HSA與ICG的連接；動態(tài)光散射測定探針的水合尺寸和ζ系數(shù)；
　　3.利用臺盼藍染色測定與GX1-HSA-ICG共孵育的 GES細胞存活率，評估GX1-HSA-ICG的細胞毒性；
　　4.使用探針與臍靜脈內(nèi)皮細胞HUVEC以及與腫瘤細胞共培養(yǎng)的臍靜脈內(nèi)皮細胞 Co-HUVEC進行結(jié)合和競爭抑制試驗，加入未標記的 GX1與GX1-HSA-ICG競爭Co-HUVEC上的結(jié)合

6、位點，驗證探針和Co-HUVEC細胞結(jié)合的特異性；
　　5.經(jīng)尾靜脈注射GX1-HSA-ICG，使用小動物活體成像系統(tǒng)（IVIS系統(tǒng)）對皮下荷胃癌小鼠進行近紅外熒光活體成像，驗證探針在體內(nèi)的胃癌靶向性。
　　6.體內(nèi)分布實驗觀察探針的腫瘤靶向特異性以及代謝器官。
　　【結(jié)果】
　　1.成功合成 GX1-HSA-ICG，SDS-PAGE凝膠電泳和考馬斯亮藍染色結(jié)果顯示GX1-HSA-ICG為較 HSA-ICG分子量

7、更大的條帶；紫外-可見光吸收光譜結(jié)果顯示GX1-HSA-ICG的吸收峰在280nm和800nm處；動態(tài)光散射結(jié)果顯示GX1-HSA-ICG的水合粒徑增加至81±4.3nm，澤塔系數(shù)為-35±0.4mV。
　　2. GES細胞分別與以下溶液共孵育4小時，在PBS組、ICG組、HSA-ICG組和GX1-HSA-ICG組的存活率分別為96±1.52％，95±1.15%，95±1.37%，96±1.78%，無統(tǒng)計學差異；
　　3.細

8、胞結(jié)合與競爭抑制實驗顯示，在ICG組、HSA-ICG組、GX1-HSA-ICG組、封閉組，HUVEC細胞與Co-HUVEC細胞組的平均輻射效率[p/sec/cm2/sr]/[μW/cm2]分別為：3.09±1.09×108 vs3.76±1.21×108，1.54±0.21×108 vs1.78±0.09×109，8.83±0.83×108 vs1.51±0.01×109，1.93±0.27×108 vs2.31±0.36×108，在G

9、X1-HSA-ICG組Co-HUVEC細胞的平均輻射效率較HUVEC細胞顯著增強（P<0.01）；
　　4.荷胃癌小鼠活體成像結(jié)果顯示，第24小時的腫瘤與背景的平均熒光信號強度比（TBR），GX1-HSA-ICG(7.81±0.32)組和ICG組(3.62±0.16)、HSA-ICG組(3.51±0.23)、Block組(2.89±0.71)比較，顯著增強（P<0.01）；
　　5.探針的體內(nèi)分布實驗顯示腫瘤部位與背景的平均

10、熒光信號強度比在ICG組、HSA-ICG組、GX1-HSA-ICG組和Block組分別為：7.53±1.11，11.43±1.30，22.20±1.09和7.11±0.20，探針組較其他組顯著升高（P<0.01）,而肝臟局部TBR值在所有器官中最高。
　　【結(jié)論】
　　1.成功合成胃癌血管靶向肽GX1修飾的HSA為近紅外熒光染料ICG載體的胃癌血管靶向探針GX1-HSA-ICG；
　　2.體外實驗提示GX1-HSA-I