胃癌血管靶向蛋白GX1-rmhTNFα的發(fā)酵純化工藝.pdf

1、胃癌是一種最常見(jiàn)的人類(lèi)惡性腫瘤,居全球癌癥死亡率的第二大原因,預(yù)后較差,在我國(guó),5年期胃癌的生存率低于20％-25％。早期胃癌可以通過(guò)手術(shù)切除,輔以放化療治療,極大提高患者的5年生存率。可是中晚期胃癌治療效果較差。隨著人們對(duì)腫瘤研究的深入,人們意識(shí)到腫瘤生長(zhǎng)微環(huán)境,尤其是腫瘤的血管生成,對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移的重要性。因此阻斷腫瘤血管生成成為了人們研究腫瘤治療的新方向。GX1-rmhTNFα是我們實(shí)驗(yàn)室采用基因重組技術(shù)制備的一種抑制胃癌新生血

2、管形成的藥物。rmhTNFα在我國(guó)已經(jīng)批準(zhǔn)上市用于治療小細(xì)胞肺癌,GX1為我實(shí)驗(yàn)室通過(guò)噬菌體肽庫(kù)篩選出來(lái)的靶向胃癌血管的環(huán)狀小肽,于是我們采用基因重組技術(shù)制備出GX1-rmhTNFα。前期實(shí)驗(yàn)證明該藥物通過(guò)GX1特異結(jié)合于胃癌新生血管,從而使rmhTNFα在胃癌細(xì)胞周?chē)男律芨患?能有效地抑制胃癌血管生成,達(dá)到治療胃癌的作用。
　　目的:為了進(jìn)一步加快GX1-rmhTNFα應(yīng)用于臨床治療,本課題旨在通過(guò)全面檢定采用基因重組技術(shù)

3、構(gòu)建的表達(dá)GX1-rmhTNFα融合蛋白的工程菌(DH5α/pBV-GX1-rmhTNFα),從而建立穩(wěn)定的適合大規(guī)模生產(chǎn)的工程菌菌種庫(kù),并建立發(fā)酵及純化的穩(wěn)定工藝。
　　方法:對(duì)GX1-rmhTNFα工程菌進(jìn)行全面檢定,挑取目的蛋白表達(dá)水平高的菌種擴(kuò)大培養(yǎng);采用5L發(fā)酵罐,32℃培養(yǎng)工程菌至A600值達(dá)4~6,42℃誘導(dǎo)約4h后收菌,發(fā)酵過(guò)程,控制pH值在7.2,溶氧在30％左右,采用梯度流加的方法補(bǔ)料,連續(xù)發(fā)酵3批,驗(yàn)證發(fā)酵工

4、藝的穩(wěn)定性;表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)硫酸銨分段鹽析及透析處理后活性為1.71×10~8IU/ml蛋白含量為5.918mg/ml,經(jīng)SP-Sepharose FF及Q-Sepharose FF層析純化,收集洗脫峰進(jìn)行濃度、活性、純度及Western blot分析。
　　結(jié)果:工程菌經(jīng)全面檢定,證實(shí)該重組菌構(gòu)建正確,目的蛋白表達(dá)量不低于10％,菌種穩(wěn)定性較好,呈典型的大腸桿菌特征,適合建立工程菌菌庫(kù)。連續(xù)發(fā)酵3批,濕菌收量均不低于200克,且各批菌

5、體目的蛋白表達(dá)水平均在10％以上。目的蛋白經(jīng)SP-Sepharose FF及Q-Sepharose FF柱層析純化,最終純化產(chǎn)物蛋白含量為0.901mg/ml,活性為5.97×10~8IU/ml,純度可達(dá)95％以上,經(jīng)Western blot檢測(cè),目的蛋白可與相應(yīng)單抗發(fā)生特異性免疫反應(yīng)。
　　結(jié)論:采用基因重組技術(shù)構(gòu)建的表達(dá)GX1-rmhTNFα融合蛋白的工程菌穩(wěn)定,建立了簡(jiǎn)單可行的表達(dá)GX1-rmhTNFα融合蛋白的工程菌的發(fā)酵