靶向核酸納米歸巢氣霧裝置的構(gòu)建.pdf

1、研究背景和目的：基因治療，特別是最具前景的小分子RNA干擾作為基因藥的治療，選擇合適的載體及導(dǎo)入方法是一個(gè)瓶頸，也是核酸為基礎(chǔ)的藥物能否在臨床成功應(yīng)用的關(guān)鍵。病毒載體因其具有高效轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的特點(diǎn)，是目前基因治療臨床研究的主流載體。但隨著時(shí)間的推移，病毒載體介導(dǎo)免疫炎癥以及激活原癌基因的潛在危險(xiǎn)性等自身無法克服的缺陷已日益顯現(xiàn)。因此，研發(fā)非病毒載體已成為基因治療研究的熱點(diǎn)。
　　 非病毒載體具有低毒、低免疫原性等特點(diǎn)，其中的殼聚糖及

2、其衍生物因具備極高的生物相容性受到科學(xué)家們的青睞。我們?cè)谇捌诘难芯抗ぷ髦?，已?jīng)研制出烷基化殼聚糖納米核酸載體，并能成功的將靶目標(biāo)核酸轉(zhuǎn)入肺的上皮細(xì)胞，表達(dá)相應(yīng)蛋白。但存在的缺點(diǎn)是轉(zhuǎn)染效率低。精氨酸中的特征基團(tuán)胍基能夠促進(jìn)細(xì)胞的內(nèi)吞，具有細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)肽的作用，因此，對(duì)殼聚糖進(jìn)行胍基化修飾有望改善原殼聚糖納米載體轉(zhuǎn)染效率低的缺點(diǎn)。同時(shí)，β2腎上腺能受體廣泛分布于支氣管平滑肌和肺組織內(nèi)，依據(jù)配體－受體結(jié)合的原理，采納臨床用支氣管舒張劑－β2受體興

3、奮劑作為歸巢裝置，把沙丁胺醇接枝于胍基化的殼聚糖上，有望通過靶向性修飾增加其核酸轉(zhuǎn)運(yùn)的效率與特異性。不僅如此，針對(duì)特定靶器官的局部給藥方式具有吸收迅速、起效快、使用方便和副作用小等特點(diǎn)，是呼吸系統(tǒng)疾病治療一種常用有效的給藥途徑。通過探討超聲霧化運(yùn)送殼聚糖納米核酸藥的給藥方式，最終構(gòu)建一種新型RNA干擾殼聚糖納米載體靶向歸巢氣霧治療裝置，將能極大解決RNA干擾等核酸類藥物在呼吸系統(tǒng)疾病臨床應(yīng)用的問題。
　　 研究內(nèi)容和方法：

4、>　　 第一部分胍基化殼聚糖的物化性質(zhì)和基因轉(zhuǎn)染效率第一節(jié)胍基化殼聚糖物化性質(zhì)的檢測
　　 1.胍基化殼聚糖的合成；
　　 2.透射電鏡觀察Gua-chitosan/DNA的粒徑大小和分布；
　　 3.比較中性水溶液中chitosan和Gua-chitosan之間的溶解性，以及完全溶解狀態(tài)下，兩種載體溶液的PH值；
　　 4.凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)觀察兩種載體的核酸結(jié)合能力；
　　 5.利用WES-8比較

5、各種載體的細(xì)胞毒性。
　　 第二節(jié)胍基化殼聚糖轉(zhuǎn)染效率的評(píng)價(jià)與機(jī)制探討
　　 1.應(yīng)用綠色熒光蛋白報(bào)告基因載體(Enhanced green fluorescent protein plasmid，pEGFP)轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察不同殼聚糖納米載體的轉(zhuǎn)染效率，并結(jié)合流式細(xì)胞儀進(jìn)行轉(zhuǎn)染效率的定量分析；
　　 2.流式細(xì)胞儀檢測在不同載體的包裹下單個(gè)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，了解它們對(duì)GFP表達(dá)影響；
　　

6、3.觀察不同胍基取代度對(duì)殼聚糖轉(zhuǎn)染效率的影響；
　　 4.跟蹤不同時(shí)間點(diǎn)各種載體轉(zhuǎn)染效率的變化。
　　 5.連接Pet質(zhì)粒和yoyo1熒光染料，觀察各種載體向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)核酸的能力。
　　 6.連接Pet質(zhì)粒和yoyo1熒光染料，觀察各種載體在體轉(zhuǎn)運(yùn)核酸的能力。
　　 第二部分載體的靶向性改造
　　 1.沙丁胺醇接枝于胍基化的殼聚糖及質(zhì)譜分析。
　　 2．比較Sal-Gua-chitosan

7、和Gua-chitosan在具有β2受體的293細(xì)胞及不表達(dá)β2受體的16HBE細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。
　　 第三部分超聲霧化對(duì)殼聚糖核酸復(fù)合物轉(zhuǎn)染效率的影響及其機(jī)理
　　 1.凝膠電泳觀察超聲霧化下，Gua-chitosan對(duì)于DNA的保護(hù)作用；
　　 2.分別比較載體/DNA復(fù)合物經(jīng)超聲霧化以后，pEGFP在293和16HBE細(xì)胞當(dāng)中轉(zhuǎn)染效率的變化；
　　 3.透射電鏡觀察超聲霧化前后，載體和載體/DNA復(fù)

8、合物粒徑大小和分布的變化。
　　 結(jié)果：
　　 第一部分胍基化殼聚糖的物化性質(zhì)和基因轉(zhuǎn)染效率
　　 第一節(jié)胍基化殼聚糖粒徑在20-70nm之間；殼聚糖經(jīng)胍基化修飾以后在中性水溶液當(dāng)中的溶解性大大增加；胍基能降低殼聚糖自身的電荷密度，造成與DNA結(jié)合的臨界復(fù)合比升高；與天然殼聚糖相仿，胍基化改造并沒有增加載體的細(xì)胞毒性，兩者對(duì)于細(xì)胞生長率均沒有明顯影響。
　　 第二節(jié)胍基化殼聚糖轉(zhuǎn)染pEGFP的效率明顯高于

9、天然殼聚糖，這種轉(zhuǎn)染效率的提高在一定范圍內(nèi)并不依賴于胍基化程度的高低。在單個(gè)細(xì)胞的水平上，胍基化殼聚糖所轉(zhuǎn)染的綠色熒光蛋白的強(qiáng)度高于天然殼聚糖。在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，脂質(zhì)體所介導(dǎo)的基因表達(dá)達(dá)到峰值，而胍基化殼聚糖所介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染，蛋白表達(dá)的高峰出現(xiàn)在72小時(shí)。細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)和在體實(shí)驗(yàn)均顯示，胍基化殼聚糖能更有效的地把質(zhì)粒DNA運(yùn)送到細(xì)胞體內(nèi)。
　　 第二部分載體的靶向性改造
　　 與不表達(dá)β2受體的16HBE細(xì)胞比較，293細(xì)

10、胞用Sal-胍基化殼聚糖納米載體轉(zhuǎn)染綠色熒光報(bào)告質(zhì)粒的表達(dá)效率顯著高于未引入配體的胍基化殼聚糖納米載體。
　　 第三部分超聲霧化對(duì)殼聚糖核酸復(fù)合物轉(zhuǎn)染效率的影響及其機(jī)理
　　 殼聚糖能有效保護(hù)被包裹的DNA免受超聲振蕩的剪切作用。殼聚糖/DNA復(fù)合物經(jīng)超聲霧化以后轉(zhuǎn)染效率顯著提高。超聲處理后復(fù)合物粒徑分布范圍較前變窄，粒徑增大，顆粒均勻度較前明顯改善。
　　 結(jié)論：
　　 1.胍基化修飾的殼聚糖納米載體能

11、有效提高核酸的運(yùn)送及轉(zhuǎn)染效率，在生理PH值環(huán)境下能夠溶于水，為臨床局部應(yīng)用的可行性奠定了基礎(chǔ)。胍基化修飾的殼聚糖納米提高轉(zhuǎn)染效率的機(jī)制可能是通過提高細(xì)胞的內(nèi)吞作用實(shí)現(xiàn)，。該特質(zhì)性更有利于其在體轉(zhuǎn)送核酸物質(zhì)。
　　 2.Β2受體興奮劑－沙丁胺醇接枝的胍基化殼聚糖納米載體通過引入靶向歸巢裝置，能夠利用氣道細(xì)胞存在大量β2受體的特點(diǎn)，依據(jù)配體－受體結(jié)合的基本原理，進(jìn)一步提高細(xì)胞對(duì)核酸的攝取與轉(zhuǎn)染效率，為在體經(jīng)氣道局部給予核酸類藥奠定了