NAFLD細(xì)胞模型構(gòu)建、核酸適配體的篩選及靶向藥物運(yùn)輸.pdf

1、非酒精性脂肪肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指除酒精以及其他明確損肝因素所致的肝細(xì)胞內(nèi)甘油三酯過(guò)度沉積（＞5％的肝細(xì)胞組織）為主要特征的一種臨床病理綜合征。NAFLD不僅與2型糖尿病、肥胖有關(guān)，也是非酒精性脂肪肝炎(NASH)、肝硬化甚至肝癌發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)因素之一。近年來(lái)其發(fā)病率逐年增高，已經(jīng)成為一個(gè)全球性的公共健康問(wèn)題。目前治療藥物主要是針對(duì)改善胰島素抵抗和抗氧化應(yīng)激等，存在療效不確切

2、或藥物副作用大等因素，尚無(wú)治療NAFLD的特效藥物問(wèn)世。近年來(lái)，納米和核酸適配體技術(shù)在載藥及藥物的靶向性研究中得到了越來(lái)越多的應(yīng)用，是當(dāng)前生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。本文針對(duì)當(dāng)前NAFLD治療的一些難題以及治療前景，通過(guò)多學(xué)科交叉，設(shè)計(jì)并構(gòu)建了基于金納米粒子和核酸適配體的載藥載體，探索新型納米載藥載體在NAFLD治療中的應(yīng)用，為將來(lái)NAFLD進(jìn)行靶向藥物治療提供新的思路。鑒于課題的設(shè)計(jì)，本論文共分為三個(gè)部分。
　　第一部分:NAFLD

3、細(xì)胞模型的構(gòu)建、核酸適配體篩選及其特性分析
　　目的:本部分?jǐn)M建立NAFLD細(xì)胞模型，采用細(xì)胞指數(shù)級(jí)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(Systematic Evolution of Ligands byExponentialEnrichment，Cell-SELEX)針對(duì)NAFLD細(xì)胞進(jìn)行篩選，獲得能特異性識(shí)別NAFLD細(xì)胞表面膜蛋白結(jié)構(gòu)的核酸適配體，分析篩選到的核酸適配體NFD-1的相關(guān)特征，包括不同溫度下的特異性、親和性以及膜蛋白結(jié)合性

4、。
　　方法:使用100uM油酸和50uM棕櫚酸誘導(dǎo)分化HepG2細(xì)胞1周構(gòu)建NAFLD細(xì)胞模型;設(shè)計(jì)并合成隨機(jī)DNA文庫(kù)序列，中間25bp為隨機(jī)序列，兩端各有一段長(zhǎng)16bp的引物序列，分別用異硫氰酸熒光素和生物素標(biāo)記兩端引物。將NAFLD細(xì)胞作為正細(xì)胞，HepG2細(xì)胞作為負(fù)細(xì)胞，將DNA文庫(kù)與正負(fù)細(xì)胞反復(fù)孵育進(jìn)行篩選，與正細(xì)胞結(jié)合而不與負(fù)細(xì)胞結(jié)合的文庫(kù)序列采用聚合酶鏈法(PCR)擴(kuò)增并用作下一輪篩選及鑒定。每3-4輪篩選就使用流

5、式細(xì)胞技術(shù)對(duì)文庫(kù)的富集程度進(jìn)行監(jiān)測(cè)、鑒定。最后采用454測(cè)序方法對(duì)富集到的文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，合成相關(guān)序列并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行鑒定;在4℃和37℃條件下將核酸適配體NFD-1與不同組織來(lái)源的細(xì)胞株孵育，流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定其特異性，將NFD-1稀釋成不同濃度后與NAFLD細(xì)胞孵育，計(jì)算其解離常數(shù);使用Trypsin和Proteinase K兩種蛋白酶檢測(cè)NFD-1靶標(biāo)為膜蛋白。
　　結(jié)果:本實(shí)驗(yàn)成功誘導(dǎo)分化建立了NAFLD細(xì)胞模型。應(yīng)用Cel

6、l-SELEX技術(shù)對(duì)NAFLD細(xì)胞展開(kāi)篩選，經(jīng)過(guò)24輪正負(fù)篩選后成功富集到針對(duì)NAFLD細(xì)胞的ssDNA文庫(kù)，經(jīng)過(guò)測(cè)序分析找到了4條核酸適配體與NAFLD細(xì)胞有結(jié)合，而與HepG2細(xì)胞不結(jié)合，我們選用結(jié)合能力強(qiáng)的1條核酸適配體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并命名為NFD-1;在4℃和37℃條件下，核酸適配體NFD-1均能與NAFLD細(xì)胞特異性結(jié)合，而與其它組織來(lái)源的細(xì)胞株幾乎沒(méi)有結(jié)合。解離常數(shù)測(cè)定Kd值為21.5±5.6 nM，提示NFD-1能與NAFLD

7、細(xì)胞高親和力結(jié)合。蛋白酶檢測(cè)證實(shí)NFD-1的靶標(biāo)為膜蛋白。
　　結(jié)論:通過(guò)Cell-SELEX技術(shù)針對(duì)NAFLD細(xì)胞進(jìn)行篩選，獲得了1條在4℃和37℃條件下能與靶細(xì)胞膜蛋白高親和力、高特異性結(jié)合的核酸適配體NFD-1。
　　第二部分:金納米粒子載藥載體的構(gòu)建
　　目的:合成并構(gòu)建金納米粒子載藥載體，檢測(cè)其特異性。
　　方法:化學(xué)合成直徑為13nm的金納米粒子，將NFD-1和載藥GC序列修飾金納米粒子構(gòu)建載藥載體，

8、檢測(cè)其與NAFLD細(xì)胞結(jié)合的特異性。
　　結(jié)果:我們合成了直徑為13nm的金納米粒子，并成功修飾了NFD-1和載藥GC序列，檢測(cè)結(jié)果表明修飾了NFD-1的金納米粒子能特異性結(jié)合NAFLD細(xì)胞。
　　結(jié)論: NFD-1與載藥GC序列修飾的金納米粒子顯示出良好的結(jié)合特異性。
　　第三部分:修飾阿霉素并檢測(cè)修飾了NFD-1和Dox的金納米載藥載體的靶向載藥運(yùn)輸
　　目的:將阿霉素(Doxycycline，Dox)修飾到

9、金納米載藥載體并檢測(cè)Dox的效率;檢測(cè)修飾了核酸適配體NFD-1和Dox的的金納米載藥載體能否特異性進(jìn)入NAFLD細(xì)胞。
　　方法:共聚焦顯微鏡檢測(cè)修飾了核酸適配體NFD-1和Dox的金納米載藥載體特異性進(jìn)入NAFLD細(xì)胞。
　　結(jié)果:修飾了載藥GC序列的金納米載藥載體能結(jié)合300倍Dox的劑量，共聚焦顯微鏡顯示修飾了NFD-1和Dox的的金納米載藥載體能特異性地進(jìn)入NAFLD細(xì)胞。
　　結(jié)論:修飾了核酸適配體NFD-